詳細(xì)內(nèi)容
產(chǎn)品名稱：組化雙染試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50T
儲(chǔ)存溫度：-20℃ , 一年有效
本產(chǎn)品僅限于業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。
原理：
一抗識(shí)別抗原，HRP標(biāo)記二抗識(shí)別一抗，HRP催化中間體TY永久性標(biāo)記抗原且實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，紅色色原特異性識(shí)別TY產(chǎn)物（共價(jià)結(jié)合），從而實(shí)現(xiàn)了紅色信號(hào)的累積，完成了紅色顯色.常規(guī)免疫組化染色用DAB，形成棕色物質(zhì)。DAB棕色+紅色，形成了獨(dú)特的組化雙染顏色，該組化雙染信號(hào)可以中性樹膠封片，不同于傳統(tǒng)的堿性磷酸酶AEC或AP-red等紅色信號(hào)（不能中性樹膠封片）。
操作步驟：
1.石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min——二甲苯Ⅱ15min——無水乙醇Ⅰ5min——無水乙醇Ⅱ5min——85%酒精5min——75%酒精5min——蒸餾水洗。
2.抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min至沸，停火8min保溫再轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片；也可以用其他抗原修復(fù)方式，比如：95°C水浴25min或者高壓等。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4.BSA/封閉液封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
5.加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一抗說明書推薦比例配好的指標(biāo)一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
6.加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
7.DAB顯色：將DAB與DAB buffer按1：100配制成工作液，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。
8.抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原第二次修復(fù)。中火8min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。也可以用其他抗原修復(fù)方式，比如：95°C水浴25min或者高壓等。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）
9.BSA/封閉液封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（加固防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
10.加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一抗說明書推薦比例配好的第二指標(biāo)一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
11.加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
12.紅色顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加解凍的TY反應(yīng)液反應(yīng)20min，PBS洗三次，之后加入紅色顯色液工作液(PB:CU:紅色色原:AC=860:40:1:100)反應(yīng)15min，顯微鏡下可控制顯色時(shí)間，陽性為紅色，自來水沖洗切片終止顯色。
13.復(fù)染細(xì)胞核：用蘇木素#abs9214復(fù)染細(xì)胞核。
14.脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min——85%酒精6min——無水乙醇Ⅰ6min——無水乙醇Ⅱ6min——二甲苯Ⅰ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
15.顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。
16.石蠟切片免疫組化結(jié)果判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，指標(biāo)DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色，第二指標(biāo)紅色顯色的陽性表達(dá)為紅色或粉紅色。
注意事項(xiàng)：
1.DAB顯色盡量不要過深，過深會(huì)影響紅色顯色結(jié)果。
2.雙染的兩個(gè)抗原盡量表達(dá)位置不同（如標(biāo)記不同細(xì)胞或者不同表達(dá)位置），不適用于兩個(gè)抗原的共定位（不同于熒光的共定位）。
3.紅色顯色抗原所對(duì)應(yīng)的一抗抗體濃度適當(dāng)提高一些，組化二抗應(yīng)使用高敏多聚二抗。
4.可以標(biāo)紅色，第二標(biāo)棕色。
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原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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組化雙染試劑盒
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