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通用名稱：豬偽狂犬病毒gE基因熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Porcine Pseudorabies/ virus gE gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

包裝規格：50T/盒

預期用途：

豬偽狂犬/病毒在分類學上屬皰疹病毒科豬皰疹病毒屬。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測PPRV gE，對PRV引起的豬的疫病的診斷和監控具有重要指導意義。

豬偽狂犬/病毒（gE）檢測試劑盒原理

本試劑盒針對PPRV gE高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含PPRV gE基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【使用方法】

一、試劑準備（在試劑準備區進行）

1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。

2. 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量，按下表1單反應體系配制方法，取相應量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應分裝到PCR反應管中，瞬時離心后備用。

表1：單反應體系配制方法

試劑	反應液	混合酶
用量	19 μL	1 μL

二、樣本準備（在樣本準備區進行）

1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說明書進行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測，建議-70℃以下保存。

2. 取出樣本后混勻，將陰性對照、待測樣本、陽性對照各5 μL加入到PCR反應管中混勻。

3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。

4. 將PCR反應管轉移到擴增區進行上機。

三、PCR（在核酸擴增區進行）

1. 將上述PCR反應管按照實驗布局依次放入PCR儀對應檢測孔內，并記錄順序。

2. 按表2設置PCR擴增循環參數。

表2：PCR擴增相關參數

體系		反應體系設為25 μL
信號采集		選擇FAM通道檢測H5亞型； 選擇CY5通道檢測H7亞型； 選擇ROX通道檢測H9亞型。
PCR 反應 條件	階段	條件	循環數
	逆轉錄	50℃：30 min	1
	預變性	95℃：5 min	1
	PCR	95℃：15 sec	45
		60℃：30 sec （此階段結束時采集熒光信號）

 

【結果分析】

表3：結果分析表

實驗成立 條件	陰性對照	三通道Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
	陽性對照	三通道Ct≤30且出現典型的S型擴增曲線。
樣本結果 判定標準	H5亞型 陽性	FAM通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。
	H7亞型 陽性	CY5通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。
	H9亞型 陽性	ROX通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。

 

結果可疑	任一通道35＜Ct≤38，建議復測，復測結果仍為可疑，且出現明顯指數增長，判為陽性。否則為陰性。
結果陰性	Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關基因擴增檢驗實驗室管理規范進行管理。

2. 各區域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測結束后，應立即對工作臺進行清潔消毒。

3. 吸取反應液時，應盡量避免產生氣泡。上機，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發造成結果不準確。

4. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內，檢測結束的PCR反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

5. 工作臺及各種實驗用品應定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒。

6. 試劑使用應在常溫下充分融化并混勻。不同批號的試劑請勿混用，并在有效期內使用。

【儲存條件與有效期】

試劑盒應置于-20℃冷凍避光貯存；

試劑盒保存有效期為12個月；

試劑盒反復凍融次數不宜超過5次。

 

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司

標簽：豬偽狂犬病毒gE基因熒光PCR檢測試劑盒   PCR試劑盒   

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