詳細(xì)內(nèi)容
點擊次數(shù)：528 發(fā)布時間：2024/11/18
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒高致病性變異株熒光RT-PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品概述：
高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive ａnd Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)，屬于正鏈 RNA 病毒基因。高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染的病豬癥狀為豬體溫升高，豬身呈紫色斑塊，出現(xiàn)敗血癥，懷孕母豬流產(chǎn)、死胎，大量發(fā)病豬死亡，該疫情給豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此快速檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒具有重要的意義。
產(chǎn)品內(nèi)容：
| 成分 | 規(guī)格 |
| 探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 500UL |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2 | 50UL |
| 熒光PCR 用模板稀釋液 | 1ml |
| 高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 qRT-PCR引物-探針干粉 | 50次 |
| 高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 qRT-PCR陽性對照(1×10E7 拷貝/μL) | 50ul |
| 使用手冊 | 1份 |
注意：引物-探針干粉在使用需要短暫離心，然后在離心管中加入 165 μL 的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。
【使用方法】
一、試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。
2. 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按下表1單反應(yīng)體系配制方法，取相應(yīng)量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應(yīng)分裝到PCR反應(yīng)管中，瞬時離心后備用。
表1：單反應(yīng)體系配制方法
| 試劑 | 反應(yīng)液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、樣本準(zhǔn)備（在樣本準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說明書進(jìn)行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測，建議-70℃以下保存。
2. 取出樣本后混勻，將陰性對照、待測樣本、陽性對照各5 μL加入到PCR反應(yīng)管中混勻。
3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。
4. 將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行上機(jī)。
三、PCR（在核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行）
1. 將上述PCR反應(yīng)管按照實驗布局依次放入PCR儀對應(yīng)檢測孔內(nèi)，并記錄順序。
2. 按表2設(shè)置PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。
表2：PCR擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)
| 體系 | 反應(yīng)體系設(shè)為25 μL | ||
| 信號采集 | 選擇FAM通道檢測H5亞型； 選擇CY5通道檢測H7亞型； 選擇ROX通道檢測H9亞型。 | ||
| PCR 反應(yīng) 條件 | 階段 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃：30 min | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：5 min | 1 | |
| PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
| 60℃：30 sec （此階段結(jié)束時采集熒光信號） | |||
【結(jié)果分析】
表3：結(jié)果分析表
| 實驗成立 條件 | 陰性對照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。 |
| 陽性對照 | 三通道Ct≤30且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| 樣本結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn) | H5亞型 陽性 | FAM通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| H7亞型 陽性 | CY5通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| H9亞型 陽性 | ROX通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| 結(jié)果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建議復(fù)測，復(fù)測結(jié)果仍為可疑，且出現(xiàn)明顯指數(shù)增長，判為陽性。否則為陰性。 |
| 結(jié)果陰性 | Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。 |
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理規(guī)范進(jìn)行管理。
2. 各區(qū)域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺進(jìn)行清潔消毒。
3. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。
4. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
5. 工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
6. 試劑使用應(yīng)在常溫下充分融化并混勻。不同批號的試劑請勿混用，并在有效期內(nèi)使用。
【儲存條件與有效期】
試劑盒應(yīng)置于-20℃冷凍避光貯存；
試劑盒保存有效期為12個月；
試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過5次。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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