詳細(xì)內(nèi)容
點(diǎn)擊次數(shù)：539 發(fā)布時(shí)間：2024/11/18
通用名稱(chēng)：非洲豬瘟病毒（P72/CD2v/MGF）三重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【預(yù)期用途】
非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒（P72+CD2v+ MGF+IC）采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)擴(kuò)增ASFV的P72基因、CD2v基因和MGF基因，用于檢測(cè)疑似感染動(dòng)物的血液，淋巴結(jié)、脾臟、肌肉、肺臟等樣品以及口腔液、環(huán)境樣品中的非洲豬瘟病毒核酸。同時(shí)針對(duì)豬源DNA設(shè)計(jì)了內(nèi)參，對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。本試劑盒為四重實(shí)時(shí)熒光PCR，適用于非洲豬瘟病毒常規(guī)監(jiān)測(cè)、生物安全防護(hù)的應(yīng)用，也可用于流行株與CD2v基因、MGF基因缺失株感染的鑒別診斷。
【檢測(cè)原理】
非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒（P72+CD2v+MGF+IC）利用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，以非洲豬瘟病毒基因組的P72基因、CD2v 基因和MGF 基因?yàn)榘袇^(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，鑒別樣品中的非洲豬瘟病毒的流行株與缺失株。同時(shí)，本試劑盒針對(duì)豬DNA 設(shè)計(jì)了內(nèi)參對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。
【使用方法】
一、試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。
2. 根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量，按下表1單反應(yīng)體系配制方法，取相應(yīng)量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應(yīng)分裝到PCR反應(yīng)管中，瞬時(shí)離心后備用。
表1：?jiǎn)畏磻?yīng)體系配制方法
| 試劑 | 反應(yīng)液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、樣本準(zhǔn)備（在樣本準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測(cè)，建議-70℃以下保存。
2. 取出樣本后混勻，將陰性對(duì)照、待測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照各5 μL加入到PCR反應(yīng)管中混勻。
3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。
4. 將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行上機(jī)。
三、PCR（在核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行）
1. 將上述PCR反應(yīng)管按照實(shí)驗(yàn)布局依次放入PCR儀對(duì)應(yīng)檢測(cè)孔內(nèi)，并記錄順序。
2. 按表2設(shè)置PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。
表2：PCR擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)
| 體系 | 反應(yīng)體系設(shè)為25 μL | ||
| 信號(hào)采集 | 選擇FAM通道檢測(cè)H5亞型； 選擇CY5通道檢測(cè)H7亞型； 選擇ROX通道檢測(cè)H9亞型。 | ||
| PCR 反應(yīng) 條件 | 階段 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃：30 min | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：5 min | 1 | |
| PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
| 60℃：30 sec （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） | |||
【結(jié)果分析】
表3：結(jié)果分析表
| 實(shí)驗(yàn)成立 條件 | 陰性對(duì)照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。 |
| 陽(yáng)性對(duì)照 | 三通道Ct≤30且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)。 | |
| 樣本結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn) | H5亞型 陽(yáng)性 | FAM通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)。 |
| H7亞型 陽(yáng)性 | CY5通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)。 | |
| H9亞型 陽(yáng)性 | ROX通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)。 |
| 結(jié)果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建議復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果仍為可疑，且出現(xiàn)明顯指數(shù)增長(zhǎng)，判為陽(yáng)性。否則為陰性。 |
| 結(jié)果陰性 | Ct＞38或者No Ct，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。 |
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理。
2. 各區(qū)域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測(cè)結(jié)束后，應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔消毒。
3. 吸取反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。
4. 檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的吸頭，應(yīng)直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內(nèi)，檢測(cè)結(jié)束的PCR反應(yīng)管，切忌開(kāi)蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
5. 工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
6. 試劑使用應(yīng)在常溫下充分融化并混勻。不同批號(hào)的試劑請(qǐng)勿混用，并在有效期內(nèi)使用。
【儲(chǔ)存條件與有效期】
試劑盒應(yīng)置于-20℃冷凍避光貯存；
試劑盒保存有效期為12個(gè)月；
試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)5次。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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