慢病毒轉染懸浮細胞效率低的原因
閱讀次數：460 發布時間：2024/6/24 11:27:53
病毒一直是基因轉導研究中的一大利器，尤其 慢病毒 更是實驗室的常客。然而，慢病毒的存儲不當或用量不合適，可能會導致轉染效率低，細胞狀態差等情況。
慢病毒感染效率低，主要需要考慮的問題有
1、細胞是否適合用慢病毒進行感染？（慢病毒適用于大部分細胞系，例如肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞等，但也有一些細胞不適合用慢病毒感染，可能更適合用腺病毒，可查閱文獻，或咨詢上海遠慕生物）
2、慢病毒是否進行了正確的存儲和稀釋？（如果病毒存儲不當或反復凍融會降低病毒滴度/活性）
3、感染操作問題（MOI是否合適，感染方法，感染及觀察時間是否合適）
4、對于一些難感染細胞的感染方法：例如懸浮細胞可使用平角離心轉染法，其他一些較難感染的細胞可進行二次感染。
5、可以添加助轉染試劑polybrene增加感染效率
慢病毒的安全和存儲
慢病毒相關實驗需要在生物安全柜（BL-2別）內進行操作，如果不小心濺出也不要驚慌，立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干凈即可。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板等要用84消毒液浸泡后統一處理。病毒相關的廢棄物也需要特殊收集再統一經高溫滅菌處理哦。
慢病毒是存儲在-80℃的，如果您在收到慢病毒的一周內就會使用，也可放在4°C保存，避免反復凍融，有必要可以行分裝。
摸索病毒感染的MOI
MOI（Multiplicity of Infection，感染復數）是指每個細胞感染的病毒數，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數量以及目的蛋白的表達量越高。
用96孔板摸索梯度值：
實驗一天，以每毫升3~5X10^6個目的細胞接種96孔培養板中的12個孔，
體積為90 µl。感染預實驗共分為四組，每組三個不同梯度的MOI。
實驗開始，配備1X10^8TU/ml、1X10^7TU/ml、1X10^6TU/ml病毒液。
將10 µl三個不同梯度的病毒加到各組的相應孔中。加入的病毒量分別為1X10^6TU，1X10^5 TU，1X10^4 TU，而細胞經過生長，此時細胞的數目大約為1 X10^4個，所以三個孔的MOI分別為100、10、1
感染3-4天后，觀察熒光表達情況，通過細胞感染效果，確認目的細胞的感染條件和感染參數。
每孔加病毒量（µl）=MOI*細胞數/滴度（ＴＵ／ｍｌ）×１０００
確定了細胞的MOI值，下面就要開始進行細胞的感染
推薦１／２小體積感染法，即在正常培養液的一半量的情況下加入慢病毒，感染４ｈ后補足培養液至正常體積，感染２４ｈ后換液。對于適用Polybrene的細胞，也可適量加入來提升感染效率，它常用的工作濃度為6~8µg/ml。
感染后４８ｈ，對于帶ＧＦＰ報告基因的病毒，可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達效率，如果要篩選穩定攜帶Puromycin抗性基因的病毒，則需換上含適當濃度Puromycin的新鮮完全培養液。
注：不同實驗室由于細胞的來源、代數和細胞狀態等因素的影響，MOI值也略有差異，以下數據是在細胞感染效率在85-100%細胞狀態良好的情況下獲得的，僅供參考。
對于一些特殊的細胞在感染時還要注意以下事項
◆懸浮細胞：感染懸浮或半懸浮細胞，要通過平角離心轉染法，低速（200´g）離心1 h，然后放入培養箱中正常培養即可。若由于實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替。
◆難感染的細胞：對于難感染的細胞，如DC（樹突狀細胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，更換新鮮病毒進行二次感染，可顯著提升感染效率。
◆傳代能力較差的原代細胞：對于一些傳代能力較差的原代細胞，比如BMSC等，建議采用滴度更高的腺病毒進行感染。
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