質(zhì)粒克隆載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建原則
閱讀次數(shù)：455 發(fā)布時(shí)間：2024/5/6 10:10:08
質(zhì)粒克隆載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建的原則
①選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒
出發(fā)質(zhì)粒也叫親本質(zhì)粒，它應(yīng)含有質(zhì)粒克隆載體必備的元件，如復(fù)制起始位點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子等。
②正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件
一般采用限制性核酸內(nèi)切酶切割出質(zhì)粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA－－片段，還可以采用PCR技術(shù)從靶DNA中擴(kuò)增出含某種元件的特異性DNA－－片段。
③組裝合適的選擇標(biāo)記基因
構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)該組裝什么樣的選擇標(biāo)記基因，必須根據(jù)要轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞的特性來決定。
④選擇合適的啟動(dòng)子
為了構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的克隆載體，必須組裝合適的啟動(dòng)子，當(dāng)設(shè)計(jì)真核生物的基因須在原核生物中表達(dá)式，常改用原核生物或病毒(噬菌體)基因的啟動(dòng)子，而原核生物基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，仍可用原核生物基因的啟動(dòng)子。
質(zhì)粒載體的分類
按復(fù)制形式
分為嚴(yán)緊型和松弛型復(fù)制。
根據(jù)質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系或在宿主細(xì)胞的拷貝數(shù)的多少，可以將質(zhì)粒分為兩種不同的復(fù)制類型：嚴(yán)緊型和松弛型。嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制受宿主染色體DNA復(fù)制的嚴(yán)格控制，拷貝數(shù)較小一般只有1~3個(gè)拷貝。疏松型質(zhì)粒的復(fù)制宿主的控制比較松，在宿主中的拷貝數(shù)比較多，一般有10~200個(gè)拷貝，有時(shí)可達(dá)到700個(gè)。
按基因轉(zhuǎn)移性
分兩類：
（1）傳遞性質(zhì)粒：常為大型、嚴(yán)緊型質(zhì)粒；
（2）非傳遞性質(zhì)粒：多為小型、松弛型質(zhì)粒。
按遺傳性狀、產(chǎn)物分類
（1）抗生素抗性：如氨芐西林、氯霉素抗性；
（2）限制酶-修飾酶（R-M）系統(tǒng)：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株為限制和甲基化雙缺陷型。
人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體分類
高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。適合大量增殖克隆基因，或需要大量表達(dá)的基因產(chǎn)物。
低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
由 pSC101派生來的載體特點(diǎn)是分子量小的拷貝數(shù)。它有特殊的用途：當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌的死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。
失控的質(zhì)粒載體
這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。如pBEU1、 pBEU2。
插入失活型克隆載體。載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42。
正選擇的質(zhì)粒載體
直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
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