公司新聞
熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種技術手段。它通過在PCR體系中添加熒光基團來顯示DNA產物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監控的目的。并且可以通過數據分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章，走上人生巔峰呢？
引物設計的好壞，關乎著擴增效率的高低、產物特異性的與否。所以正確設計出引物是qPCR成功的步。
先，我們知道qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物設計要滿足一般PCR引物設計的原則，見下表。
除此之外，qPCR引物設計需要額外注意幾點。
1. 擴增片段長度：
擴增效率隨著擴增子長度減小而增大，建議擴增產物好在80-200bp的范圍，若產物小于75bp，擴增子很難與引物二聚體區分開，若產物大于300bp，則會因為酶活降低導致擴增效率降低。如果你的擴增產物因為實驗需求一定要在500-600bp的話，做qPCR實驗時要選用三步法擴增，不要用快速兩步法擴增。
2. 區分isoform：
對于同一個基因名來說，可能會有不同的isoform。isoform指的是，對于同一個基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個時候表達出來的的蛋白可能會有不同，所以小伙伴們在設計實驗的時候，一定要想清楚自己要做的是哪一個isoform。
舉個“栗子”：比如說一個基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉錄本之和，那么設計引物時就要針對這四個isoform的共有序列設計。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個isoform與其他三個isoform的不同序列位置設計引物。
3. 跨內含子設計引物：
跨越內含子設計引物可以區分并且規避基因組DNA污染。設計引物時需要讓一端或兩端引物跨越內含子，以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內含子長度小于20bp。（Sakharkar MK et al. Distributions of exons ａnd introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.）例如外顯子長度200bp，為了兼顧擴增子長度，我們可以把上游引物設置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設置在外顯子2的位置。
請輸入要搜索的關鍵詞
上海遠慕生物科技有限公司：細胞凍存液,氨芐青霉素溶液,人白介素ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,顯色試劑盒,新生牛血清,標準胎牛血清,牛血清白蛋白溶液,小鼠血漿,雞紅細胞,透明質酸酶溶液,微生物培養基,胰蛋白酶儲存液,兩性霉素B溶液,LB冷凍緩沖液,ABTS試劑,磷酸酶抑制劑,EB緩沖液,熒光染色試劑盒,肥大細胞染色液,人源基因質粒,胡蔓藤堿乙標準品,番茄紅素標準品，Pd-C-II標準品,知母皂苷E標準品,穿刺培養基,puc19質粒,CPD抗凝劑,熒光抗體稀釋液
地址：上海市嘉定區曹安公路5588號 電話：021-58999639 傳真：021-58999639 技術支持：阿儀網 總訪問量：7735501
客服一
