怎樣提高擴增效率和PCR的特異性?
閱讀次數(shù)：441 發(fā)布時間：2023/5/8 10:49:01
引物
引物設計：引物長度適當，18-24mers，并保證序列獨特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長度大于24核苷的引物并不意味著有更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，反而降低特異性，而且長序列比短序列雜交慢，影響產量； 引物濃度：引物的濃度會影響特異性。佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。
Mg2+
較高的Mg2+濃度可以增加產量，但也會降低特異性。為了確定佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行適Mg2+濃度測定。
退火溫度
Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。退火溫度一般設定為比引物的Tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。在理想狀態(tài)下，退火溫度應足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。
巢式PCR
使用巢式引物進行連續(xù)多輪擴增，由于同兩套引物都互補的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，從而提高PCR反應的特異性和靈敏度。
遞減PCR
通過在PCR的幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性高的目的模板會被優(yōu)先擴增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。
熱啟動PCR
通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達到變性溫度。常用的是熱啟動DNA 聚合酶，常溫時該酶活性被抑制，94-95℃加熱數(shù)分鐘后回復正常活力開始反應，這樣可以避免起始循環(huán)溫度下的非特異性擴增，大大提高了PCR反應的靈敏度及特異性。熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性重要的方法。
PCR增強劑
包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等，能構降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二結構區(qū)。
客服一
