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在細胞和基因的微觀中研究探索，遺傳報告基因是非常有用的"可視化和量化"工具，具有廣泛的應(yīng)用。熒光素酶（螢光素酶）以出色的靈敏度、使用方便、可以定量檢測而成為理想的報告基因。
熒光素酶不是特定的分子，是一類中能催化產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，不同來源的熒光素酶各有特點，可催化底物發(fā)出不同顏色的光，有的還可以配合進行雙色發(fā)光檢測。這種酶早的來源，也是有代表性一種來自學(xué)名為Photinus pyrali＇的北美螢火蟲體內(nèi)的螢光素酶，之所以稱為螢光素酶，一方面也有助于區(qū)分需要激發(fā)光源才可以生成激發(fā)熒光的熒光蛋白，而螢光素酶是一個催化底物分解的發(fā)光反應(yīng)，熒光素酶在細胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測非常微弱的表達，靈敏度更高。不過，隨著發(fā)光檢測設(shè)備的不斷推進和升，生物發(fā)光靈敏度高，檢測方便的優(yōu)勢使得這類酶與熒光蛋白一起漸有取代其他報告基因的趨勢。于是，越來越多新的并非來自螢火蟲的新熒光素酶進入市場，不再是“螢光”的天下了。
種類更多
來自螢火蟲的熒光素酶是經(jīng)典的熒光素酶，這個61KD單體酶無需修飾直接具有酶活，催化反應(yīng)依賴ATP，很適合作為遺傳報告基因，也為人熟知；此外還有Renilla（海腎）熒光素酶，只有36KD大小的蛋白，底物是腔腸素，只需要氧氣，不需要ATP，發(fā)藍色光，一直是螢火蟲熒光素酶的替代，并常與螢火蟲熒光素酶組合成為雙色檢測，或者作為內(nèi)對照。
那么，讓我們來看看現(xiàn)在有哪些新熒光素酶了？
1. Gaussia熒光素酶，這是一種分泌型的藍色熒光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信號肽，可以引導(dǎo)熒光素酶分泌到細胞培養(yǎng)上清中，從而無需裂解細胞即可檢測報告基因活性。所表達的熒光素酶85%以上都會分泌至胞外，不過由于這種分泌型熒光素酶產(chǎn)生的信號比來自Firefly（螢火蟲）或Renilla（海腎）的信號強很多倍，所以還可以在細胞裂解物中檢測到細胞內(nèi)殘留的熒光素酶。分泌表達為檢測帶來很大的方便——不需要裂解珍貴的細胞，即可作活細胞實時動力學(xué)分析，連續(xù)時間曲線研究。可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測系統(tǒng)。
2. Cypridina（海螢）熒光素酶也是一種分泌型熒光素酶，呈美麗的藍紫色，蛋白分子量大小有62KD。同Gaussia一樣，大部分熒光素酶產(chǎn)物會分泌到胞外，可對活細胞實施連續(xù)檢測，非常方便。由于信號很強，細胞內(nèi)殘留的熒光素酶還足以進行常規(guī)的裂解細胞檢測，可實現(xiàn)多重檢測。Cypridina（海螢）熒光素酶可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測。
3. Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然Firefly（螢火蟲）熒光素酶(綠色)相比，其發(fā)射峰遷移至紅光光譜區(qū)。這對于一直以來都是“綠肥紅瘦”的熒光素酶真是好消息。正是由于Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶的這種光譜遷移，使其能夠與Gaussia、Cypridina（海螢）或Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶很好地區(qū)分開，從而可以組合使用。
4. 可共用同一底物的紅、綠兩色的叩頭蟲螢光素酶，大小一致，底物一致，相差只有幾個氨基酸，是雙色檢測的好選擇。
5. Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然的Renilla（海腎）熒光素酶相比，在血清中穩(wěn)定性更高，發(fā)光強度更好。因此，使用綠色海腎（Green Renilla）熒光素酶報告基因檢測靈敏度更高。
同樣作為理想報告基因的熒光蛋白如GFP如早也已經(jīng)是繽紛的七彩了，那么熒光蛋白和熒光素酶各自的特點在哪里呢？熒光蛋白并不是自身發(fā)光，而是需要一個激發(fā)光源才可以生成發(fā)射熒光，其發(fā)光能量來自于激發(fā)光。熒光蛋白的優(yōu)點在于檢測不需要底物，無創(chuàng)，也不需要干擾細胞即可進行連續(xù)檢測；但激發(fā)光會引起背景熒光干擾（細胞、容器等在激發(fā)光源下也會產(chǎn)生一定的熒光），通常用于定性，或者半定量。
而熒光素酶發(fā)光是一個酶促反應(yīng)，需要加入底物后才有發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生。分泌型的熒光素酶需要取出上清進行反應(yīng)，對于胞內(nèi)表達的熒光素酶來說還需要裂解細胞才能檢測。其優(yōu)點在于熒光素酶在細胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測非常微弱的表達，具有超高的檢測靈敏度及寬廣的動力學(xué)檢測范圍，可以精確定量。
檢測試劑靈敏度更高
如的熒光素酶來源各不相同，各有所長，對應(yīng)的檢測試劑自然也越來越多花樣和講究。在過去只有螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的時代，因為這兩者都是胞內(nèi)表達，要檢測需要先裂解細胞，而且螢火蟲螢光素酶催化底物發(fā)光的持續(xù)時間比較短，對于批量處理來說需要配備自動進樣裝置的檢測設(shè)備，委實有點兒麻煩。如有了分泌型表達的熒光素酶，就可以直接取上清進行檢測，無需裂解細胞，可作活細胞實時動力學(xué)分析，進行連續(xù)時間曲線研究，這就方便多了。分泌型熒光素酶進入液相后會不會因為稀釋而大大降低信號強度？這看來不用擔(dān)心，兩大類分泌型的熒光素酶催化底物的發(fā)光信號比原來的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶要高出2-3個數(shù)量，自然更靈敏，更適合微孔板檢測。
不僅如此，如熒光素酶檢測試劑可根據(jù)所產(chǎn)生的發(fā)光信號持續(xù)時間長短而細分為閃光型和輝光型。閃光型和輝光型發(fā)光信號的主要區(qū)別是它們的動力學(xué)行為不同。加入底物后，閃光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生瞬時的發(fā)光信號，而輝光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號，有的可持續(xù)數(shù)小時。不難想象，通常閃光型發(fā)光強度會更大，檢測靈敏度比同類的輝光型酶發(fā)光強度更高。但輝光型檢測試劑因為發(fā)光持續(xù)時間長，無需使用自動進樣器，批處理起來也容易些。在選擇檢測試劑時需要特別注意。
單螢光素酶檢測的選擇相當(dāng)豐富，研究人員可以根據(jù)研究的需要自由組合不同的熒光素酶進行多重檢測。
神奇的雙報告檢測新方法
說到多重檢測，值得注意的是，在用熒光素酶定量基因表達時，通常會采用第二個報告基因作為內(nèi)對照，使個報告基因的檢測均一化，從而減少實驗的變化因素干擾，比如, 培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別, 細胞毒性，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等。
雙熒光素酶檢測可用于以下研究方向：
同時分析多個調(diào)控元件
同時分析多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
單次篩選一個以上的靶點，包括脫靶效應(yīng)
分析兩個或多個通路之間的相互作用
雖然在過去，也有采用熒光素酶結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)組合作為雙報告基因體系，但熒光素酶定量檢測可在幾鐘內(nèi)完成, 而CAT, β-Gal和GUS則需要長時間的預(yù)處理；許多類型的細胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達, 不利于準(zhǔn)確定量報告基因的表達, 采用高溫下預(yù)處理細胞裂解液可降低內(nèi)源性β-Gal和CAT的干擾，但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此,在此類雙報告基因檢測中, 必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細胞裂解液，相當(dāng)麻煩。
雙螢光素酶報告基因技術(shù)，結(jié)合了螢火蟲熒光素酶檢測和海洋腔腸熒光素酶檢測，可在單管中進行雙熒光素酶報告基因檢測,快速,靈敏,簡便。但是早期的雙螢光素酶技術(shù)需要先裂解細胞，檢測螢火蟲螢光素酶，然后淬滅螢火蟲螢光同時激活海腎螢光素酶，再做第二個檢測，看起來有點麻煩，如提供了Dual-Glo改進成為加樣-檢測的均質(zhì)試劑。
不過方便的還是雙分泌型檢測：這是一種兩步法的檢測，可用于實時監(jiān)測Gaussia分泌型熒光素酶和Cypridina（海螢）分泌型熒光素酶。這個雙報告系統(tǒng)可對來自同一細胞培養(yǎng)上清的熒光素酶進行動力學(xué)測定，靈敏度高，不僅節(jié)省了樣品處理時間，還降低了檢測的差異性。這兩種發(fā)光波長接近，不能用濾光片區(qū)分，需要將上清分為兩組分別用兩種底物檢測兩種酶活性。由于兩種熒光素酶的底物完全不同，所以可以有效區(qū)分兩種酶的活性。
除了雙分泌型檢測，還有3組雙報告基因檢測（檢測胞內(nèi)熒光素酶）：
Gaussia –Red Firefly熒光素酶
Cypridina –Red Firefly熒光素酶
Green Renilla –Red Firefly熒光素酶
這是以光譜范圍來分辨兩種不同熒光素酶所產(chǎn)生的發(fā)光信號的方法，只需一步操作可實現(xiàn)雙重檢測。只用添加一種試劑（包含兩種底物），即可通過轉(zhuǎn)換濾光片對兩種發(fā)光信號同時進行檢測。這樣就可以省去了淬滅步驟和分步檢測的麻煩，在同一個樣品中同時對不同熒光素酶活性進行測定，操作簡單，結(jié)果同步性更好。其中的關(guān)鍵在于，每個組合中的兩個報告基因的發(fā)射光譜波長相差足夠遠，能讓儀器很好的區(qū)分開。這時可以看出Red Firefly熒光素酶的光譜紅移的重要意義了吧。值得一提的是兩種分泌型熒光素酶，面介紹過，雖然大部分的表達產(chǎn)物分泌到胞外，但細胞內(nèi)仍有足夠強的熒光素酶活性，可用閃光或輝光型檢測試劑來檢測。
在實用中，熒光素酶的優(yōu)勢在于高的靈敏度和寬廣的動態(tài)范圍可方便的進行定量分析。熒光素酶的靈敏度很大程度取決于產(chǎn)生熒光的強度。比較下來，分泌型熒光素酶，Cypridina（海螢）和Gaussia熒光素酶的發(fā)光強度高，其次是Renilla（海腎）熒光素酶，后是Firefly（螢火蟲）熒光素酶。
其他應(yīng)用
熒光素酶可被用做單報告基因在特定生物實驗中研究某一生物學(xué)事件。因不同熒光素酶的發(fā)光光譜特性和底物都是不一樣的，所以還可以將多個不同的熒光素酶組合使用，進行多重檢測。
多重檢測更適用于以下方面：
同時研究多個基因的表達調(diào)控
降低脫靶效應(yīng)
識別兩個或多個信號通路間的相互作用
將實驗體系產(chǎn)生的“假象”歸一化
應(yīng)用
啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子
藥物篩選
siRNA和miRNA篩選
分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測
活細胞的實時動態(tài)研究
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析
難轉(zhuǎn)染的細胞（包括干細胞和原代細胞）的研究
RNA 剪接研究
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