黄色电影香蕉AV_日韩欧美国产黄色片_久久久av波多野结衣区二区_婷婷成人五月天爱激情_国产精品无码久久AV嫩草_91日韩成人在线_sashagrey无码二区_国产麻豆精品国产91久久久久_欧美日韩国产aaa_久久青草视频免费播放

　　蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學技術。蛋白表達系統是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系，通過這個體系可以實現外源基因在宿主中表達的目的。

1、宿主。表達蛋白的生物體�？梢詾榧毦�、酵母、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。
2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。
3、輔助成分。有的表達系統中還包括了協助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。

一、大腸桿菌表達系統

在各種表達系統中，早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統，也是目掌握為成熟的表達系統。大腸桿菌表達系統以其細胞繁殖快速產量高、IPTG誘導表達相對簡便等優點成為生產重組蛋白的chang用的系統。目chang用的大腸桿菌表達系統為BL21-PET表達系統，此系統目已經商業化，并且普遍應用于各大實驗室和生物技術公司。

對于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。目已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動子和有效核糖體結合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個蛋白質或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現表達載體、帶伴侶的表達載體。

優點：遺傳背景清楚；繁殖快、成本低、抗污染能力強；表達量高、表達產物分離純化相對簡單、穩定性好；商品化的載體和菌株種類非常齊全、適用范圍廣等。

缺點：
① 沒有真核轉錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；
② 沒有真核翻譯后加工的功能，表達產生的蛋白質，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構像折疊，因而產生的蛋白質常沒有足夠的生物學活性；
③ 表達的蛋白質經常是不溶的，會在細菌內聚集成包涵體，尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。細菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經過復性，使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構象和良好生物活性的蛋白質，常常是一件很困難的事情。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。
④ 可能會產生一些致熱源(內毒素)，并且大腸桿菌本身含有內毒素和有毒蛋白，可能混雜在終產物里。

二、酵母表達系統

酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程域中得到日益廣泛的應用，應用此系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規模蛋白的強有力的工具。

常用的酵母表達系統有釀酒酵母表達系統和甲醇營養型酵母表達系統。甲醇酵母表達系統是目應用廣泛的酵母表達系統。目甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬應用多。

優點
1. 生長方面：酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖快速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產品時有效降低了生產成本。畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏愛性，可進行細胞高密度培養，利于大規模工業化生產。
2. 安全性方面：釀酒酵母被認為是安全無毒的，有著數十年的大規模發酵研究基礎。
3. 分子生物學操作方面：釀酒酵母在重組DNA中的廣泛研究也是基于其己被人們掌握的大量分子生物學及生理學信息。外源基因一般和表達載體一起整合到了酵母染色體上，隨染色體一起復制和遺傳，不會發生外源基因的丟失現象。
4. 蛋白表達方面：可以進行蛋白的糖基化，而且還能分泌重組蛋白。
5. 蛋白分泌方面：由于畢赤酵母自身分泌到培養基中的蛋白很少，因此純化方便。

缺點
1. 克隆基因的表達量低，發酵時間長，不正確的蛋白糖基化及抗細胞分裂。
2. 培養上清多糖濃度高，不利于純化。

三、昆蟲表達系統

昆蟲表達系統是一類應用廣泛的真核表達系統，它具有同大多數高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達系統是目國內外十分推崇的真核表達系統。利用桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動子構建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。它具有真核表達系統的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；其高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個感染昆蟲細胞內同時表達多個外源基因的能力；對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子。

桿狀病毒系統的主要優點包括：

1．組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配
2．蛋白翻譯后的加工修飾
3．表達水平高，可達總蛋白量的50%
4．可容納大分子的插入片段
5．能同時表達多個基因。
主要缺點是外源蛋白表達處于晚期病毒啟動子的調控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。

四、哺乳動物表達系統

哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。利用質粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。

根據目的蛋白表達的時空差異，可將表達系統分為瞬時、穩定和誘導表達系統。瞬時表達系統是指宿主細胞在導入表達載體后不經選擇培養，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫;瞬時表達系統的優點是簡捷，實驗周期短。穩定表達系統是指載體進入宿主細胞并經選擇培養，載體DNA穩定存在于細胞內，目的蛋白的表達持久、穩定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩定表達相對耗時耗力。誘導表達系統是指目的基因的轉錄受外源小分子誘導后才得以開放。采用異源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產量。

哺乳動物細胞表達系統常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH/3T3等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時應根據具體情況而定。

優點
1. 蛋白活性：由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。
2. 哺乳動物細胞表達外源蛋白的da優點是正確的高結構（如糖基化）。
3. 哺乳動物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，適合表達完整的大分子蛋白。

缺點
培養基成本高，培養周期長，至少一個月以上，培養較困難，表達量較低。
構成復雜、操作技術要求高、表達產量不大、產率低，且有時會導致病毒感染。