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　　隨著熒光檢測(cè)的普及，許多科研人員將western blot的檢測(cè)方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒狻＿@是因?yàn)闊晒鈾z測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。另外，熒光的好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。為了讓你的實(shí)驗(yàn)過(guò)程能輕松+成功，小編帶來(lái)了一些熒光western blot的小貼士！

熒光Western Blot基礎(chǔ)知識(shí)

熒光western blot可以進(jìn)行多重檢測(cè)并生成可定量的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)滿足期刊雜志對(duì)于數(shù)據(jù)發(fā)表的要求。熒光檢測(cè)解決了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)所面臨的一些局限性，例如：數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，半定量，動(dòng)態(tài)范圍等問(wèn)題。所以熒光Western blot變得越來(lái)越流行。對(duì)于需要更復(fù)雜的信號(hào)線性分析和蛋白豐度相關(guān)性的研究人員來(lái)說(shuō)，熒光方法是一個(gè)很好的選擇。

一旦你決定使用熒光數(shù)字成像系統(tǒng)，下一步就是仔細(xì)考慮印跡試劑了。高品質(zhì)，低熒光膜是熒光Western blotting的shou選。也需要優(yōu)化封閉液和漂洗液，提供更好的解決方案。小伙伴在從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)換到熒光檢測(cè)時(shí)遇到的大問(wèn)題是高背景。使用正確的膜，以及封閉液和漂洗液，將確保你開(kāi)始正確的熒光western實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)印過(guò)程中，關(guān)鍵是要使用一種不會(huì)產(chǎn)生太多熱量的協(xié)議。高溫會(huì)導(dǎo)致背景升高，特別是在可見(jiàn)熒光檢測(cè)中。因此，在不產(chǎn)生過(guò)多熱量的緩沖液中，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)是理想的選擇。

后和具挑戰(zhàn)性的試劑選擇是熒光二抗的選擇。幸運(yùn)的是，隨著熒光檢測(cè)方法的日益普及，市場(chǎng)上有大量的商品化的熒光二抗可供選擇。在選擇抗體染料偶聯(lián)物之，了解成像系統(tǒng)每個(gè)通道的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是很重要的。一旦了解了這些信息，您就可以選擇與您的系統(tǒng)兼容的染料。

如何提高熒光western blot檢測(cè)效果

用滴定法測(cè)定一抗和二抗的原始濃度。

多重檢測(cè)之，先分別對(duì)目的蛋白和內(nèi)參進(jìn)行優(yōu)化。

一抗的使用濃度要高于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光的2-5X。二抗的濃度也需要增加，一般建議使用的初始稀釋度是1:5000。

使用低背景的PVDF 膜。NC 膜和一些PVDF 自發(fā)熒光較高， 引起高背景。

避免標(biāo)記和染料本身產(chǎn)生的熒光。使用鉛筆標(biāo)記印跡膜。例如溴酚藍(lán)和考馬斯亮藍(lán)都有自發(fā)熒光。

保持潔凈，在使用對(duì)托盤(pán)等設(shè)備進(jìn)行清洗，戴手套處理凝膠，用鑷子處理膜。

熒光抗體要避光保存，防止發(fā)生淬滅現(xiàn)象，影響抗體的使用。

當(dāng)進(jìn)行多重檢測(cè)的時(shí)候，染料要避免重疊，選擇光譜距離較遠(yuǎn)的染料進(jìn)行孵育。

想要保存印跡膜，需要將其避光保存。