、核酸的純化
在分子克隆的所有操作中，zui基本的操作是核酸的純化。其關(guān)鍵步驟是去
蛋白質(zhì)，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當(dāng)需要把克隆有某些所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下步時(shí)，可進(jìn)行這種抽提。然而，如要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對(duì)多種天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：這兩種有機(jī)溶劑合用，比單獨(dú)用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿。②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀。③12000×g室溫離心15。④水相移入另離心管，棄去兩相界面和有機(jī)相。⑤重復(fù)步驟①－④步操作，直至兩相界面上見不到蛋白質(zhì)為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
二、核酸的濃縮
應(yīng)用zui廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽離子存在下，加入定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對(duì)低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。
具體操作時(shí)，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價(jià)陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15－30min，取出目測(cè)平衡，0－4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。
單價(jià)陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時(shí)應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時(shí)，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。
三、DNA、RNA的定量
準(zhǔn)確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的（即無顯著的蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的光吸收，然后，按IA260相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計(jì)算你的樣品含量。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時(shí)就無法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。可將樣品純化后再作定量測(cè)定。有豐富實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人，僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強(qiáng)度，即可大致判斷出樣品中的核酸含量，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。
客服一
