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困難樣本RNA提取的技能你get到了嗎?
閱讀次數:630 發布時間:2020/11/27 11:01:04
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DNA、RNA和蛋白質是三種重要的生物大分子,是生命現象的分子基礎。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀,而mRNA在信息傳遞中起著重要的作用。其他兩大類RNA,即rRNA和tRNA同樣在蛋白質的生物合成中發揮著不可替代的功能。因此RNA在DNA和蛋白質中間起著中介的作用,其重要性不言而喻。

在研究RNA的分子實驗中,獲得高質量的RNA至關重要,但是有些樣本因為細胞結構特殊、代謝產物極其豐富、本身RNA豐度低等因素,影響到RNA提取質量。另外,由于RNA酶的廣泛存在并難以消減的頑強特性,使得RNA的抽提純化更為困難。

那么今天我們針對RNA提取相關知識展開簡短的介紹~

一、 RNA提取原則

(1) 保證RNA分子的完整性

(2) 排除DNA分子的污染

(3) 排除有機溶劑、金屬離子、蛋白質、多糖、多酚、脂類的污染

(4) 獲得足量的核酸

(5)方法操作簡便,穩定性強



 不同組織中RNA豐度示意圖

二、 RNA種類

有mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA、circRNA、miRNA、piRNA、siRNA等

三、 RNA提取注意事項

1、操作環境干凈無灰塵,嚴格戴好口罩、手套等。

2、實驗所涉及的離心管、槍頭、移液器、電泳槽、實驗臺面等要用RNase抑制劑徹底處理。

3、實驗所涉及的試劑、溶液,尤其是水必須確保RNase-Free。

4、選擇合適的勻漿方法。

5、選擇合適的裂解液。

6、控制好樣品的起始量。

7、控制好裂解液與樣品量的比例。

8、RNA抽提成功的經濟標準是后續實驗的一次成功,而不是得率。即綜合RNA的得率和純度。

四、 RNA提取原理及常用方法問題

1、 RNA提取原理

RNA提取步驟,大致可分為裂解和純化。首先對樣品裂解,采用機械力、化學試劑等方法將RNA釋放出來,隨后去除蛋白質、糖、酚、金屬離子等雜質,再用無水乙醇、異丙醇沉淀或載體吸附RNA,之后洗滌溶解即可得到核酸。

2、RNA提取常用方法

    異硫氰酸胍/苯酚法(如Trizol法)

    試劑盒過柱法

    磁珠法

    改良方法

3、RNA提取過程中常見問題





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