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全轉錄組這么火，怎么做？小編帶您一文參透全轉錄組測序的研究套路！
一、什么是全轉錄組？
全轉錄組是指特定組織或細胞在特定狀態下轉錄出的所有轉錄本信息的總和，包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA等編碼和非編碼RNA。轉錄組學作為科學研究的基礎，其研究意義的重要性眾所周知。近年來，除了魅力不減當年的miRNA、炙手可熱的lncRNA外，ceRNA分析也開始嶄露頭角，成為科研界的耀眼明星。
二、為什么做全轉錄組測序？
想解答這個問題，咱們先來聊聊什么是ceRNA。
ceRNA (competing endogenousRNA，競爭性內源RNA) 并不是新的RNA分子，而是一種全新的基因表達調控模式，ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機制。
ceRNA—競爭性內源RNA
mRNA或ncRNA上存在可被miRNA結合的區域，即MREs功能元件，包含同源MREs的RNA分子可競爭性的結合miRNA。已知miRNA可通過結合靶基因導致基因沉默，所以ceRNA可以通過競爭性地結合miRNA來調控靶基因的表達[1]。
目前，單一的mRNA或ncRNA研究已不能滿足科研需求，結合多種RNA信息進行ceRNA聯合分析，探究其潛在的調控網絡機制已成為解釋生物學現象的利器！
三、全轉錄組測序怎么做？
全轉錄組測序即應用RNA-seq技術，通過構建兩種文庫—小RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫，可一次性分析4種RNA (miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA) 信息。
3.1分析內容
全轉錄組分析內容更全面，除4種RNA標準分析外，還包含ceRNA聯合分析，更可附贈高級分析內容，超值超優惠！
全轉錄組測序信息分析流程
ceRNA互作調控網絡[2]
3.2 研究思路
全轉錄組測序研究思路
1）確定研究對象
對照組&處理組；健康組&疾病組；癌組織&癌旁組織……
2）應用RNA-seq獲得4種RNA數據
3）篩選差異表達的mRNA，lncRNA，miRNA，circRNA
4）構建ceRNA調控網絡，篩選ceRNA-mRNA調控pairs
5）QRT-PCR驗證其表達量相關性
6）ceRNA調控關系驗證
a. 從蛋白水平、RNA水平等驗證ceRNA對靶標基因的作用；
b. 分析miRNA結合位點，ceRNA-miRNA調控關系；
7）功能驗證
a. 細胞水平：細胞增殖，細胞凋亡及周期變化，腫瘤轉移等；
b. 分子水平：Western Blot和免疫組化，siRNA干擾/過表達載體，免疫沉淀（IP）等；
c. 動物實驗：構建動物模型，腫瘤模型；
d. 臨床層面：檢測動物表型及生化指標變化，術后恢復情況。
3.3 案例解析
實踐是檢驗真理的標準，文章是總結思路的一大法寶！近期發表在Nature communications的兩篇文章，分別以lncRNA，circRNA為主要研究點，結合mRNA，miRNA數據進行ceRNA分析，探究其調控機制。
1. 前列腺癌中lncRNA介導的sponge調控網絡[3]
研究表明，lncRNA可作為miRNA海綿競爭性結合mRNA。文章通過生物信息學分析篩選到2個sp-lncRNA，并確定PTEN為其調控基因，通過miRNA發揮作用，從而表明lncRNA介導的海綿調控網絡在癌癥調控中發揮重要作用。
2. circRNA的miRNA海綿作用機制[4]
文章應用RNA-seq技術篩選差異circRNAs，確定circHIPK3為目標分子，并進行鑒定及生成、胞內定位等研究；通過miRNA結合位點分析并結合多重實驗驗證，表明circHIPK3可作為miRNA海綿發揮調控作用。
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