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材料

緩沖液及溶液

關于貯存液，緩沖液，試劑組分見附錄 I。
用前稀釋貯存液至合適濃度。

對照覆蓋溶液（每個分析的重組噬斑需 6 ml)

10 mmol/LMgSO₄
0.5X LB 培養液
LB 配方見附錄 2，高壓滅菌后加入 1mol/LMgSO₄ 使終濃度為 10 mmol/L, 每個 150 mm 瓊脂板需 6 ml 本溶液

IPTG 覆蓋溶液（每個分析重組噬斑需 12 ml)

0.5XLB 培養液
5 mmol/L IPTG
10 mmol/L MgS0₄

LB 配方見附錄 2.0.5xLB 培養液高壓滅菌加 1mol/L IPTG(2.38 gIPTG 溶于終體積為 10 ml 的無菌水中）與 1mol/L MgSO₄ (24.6 gMgSO₄•7 H2O 溶于終體積為 100 ml 的無菌水中)，使其終濃度分別為5nmol/L 和 10mmol/L。每 150 mm 瓊脂板需 12 ml IPTG 覆蓋溶液MgSO4•7 H20(1mol/L)

SM 溶液

培養基

LB 瓊脂板（150 mm)
室溫平衡的新鮮鋪制的平板效果*佳。

含 50ul/ug 氨芐青霉素的 LB 培養液

含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 頂層瓊脂

離心機及轉子
Sorvall SS-34 轉子或同等產品

專用設備

預設在 4°C 的空氣培養箱

載體及細菌株

λgtll 噬菌體重組體
吸單個噬斑加到約 100ulSM 中室溫放置至少 2 h 制成已知滴度的λ噬菌體重組體貯存液，或通過平板裂解液制備（見第 2 章方案 3)

E.coli Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通過 ATCC(www.atcc.org) 獲得，在含有 50ul 氨芐青霉素的 LB 瓊脂板上保存，此菌株在編碼 ATP 依賴的蛋白酶的基因攜帶有突變。在此菌株表達的融合蛋白比在不攜帶這個突變的菌株中要穩定的多。

方法

1. 取大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株的單個克隆，接種到 50 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養液中，37°C 過夜培養并溫和振蕩（搖床 250r/min)。

2. 將培養物轉移至離心管中，室溫 4000 g(SorvallSS-34 型轉子 5800r/min) 離心 5 min。

3. 去上清，用 20 ml10 mmol/LMgSO₄ 重懸細胞，測定細胞懸液稀釋 100 倍時 OD₆₀₀ 值。用 10 mmol/LMgSO₄ 稀釋細胞懸液使 OD₆₀₀ 值達到 2.0 OD₆₀₀/ml, 制成鋪板貯存液。

4. 取 3 管 0.2 ml 小份大腸桿菌 Y1090 hsdR 鋪板貯存液轉移至新鮮的管中，其中 2 管加 2X10⁵ 到 5x10⁶pfu 的重組λgtll 噬菌體貯存液，第三個管做未感染對照。37°C 溫育 20 min, 以使噬菌體吸附到細胞上。

5. 向一管中加入 7.5 ml 含 10 mmol/LMgS0₄ 及 50ug/ml 氨芐青霉素的熔化的 LB 頂層瓊脂，混勻，迅速將頂層瓊脂鋪到 150 mmLB 瓊脂板上。

6. 重復步驟 5 直至全部管均完成。

7.42°C 溫育瓊脂板 4 h。

8. 從培養箱中取出平板，向一個感染的平板加 6 ml 對照覆蓋液，另外兩管中加 12 mlIPTG 覆蓋液。

9. 重新放回 42°C 培養箱 3~5 h。

10. 從培養箱中取出平板，將覆蓋液轉人單個的無菌管中。
融合蛋白裂解后立即從感染的細胞中釋放出來與覆蓋液混合。多數細菌碎片留在瓊脂糖中而不會污染覆蓋液。
每 150 mm 平板可產生 200ug 融合蛋白。根據 Huang 和 Jong（1984) 介紹的方法，毎板*多可以重復銹導 5 次，但表達量是在前兩次誘導中產生。重復誘導時，可移去混有蛋白質的覆蓋液，平板在 37°C 復活 1 h, 再加入新鮮覆蓋液即可。
本方案還可進行變通（LillibridgeandPhilipp1993), 表達目的融合蛋白的重組噬菌體可在大腸桿菌菌苔上形成一個大的巨型噬斑。將噬菌斑與其下的瓊脂一同挖走. 在勻漿器中破碎，2XSDS 上樣緩沖液中重懸，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡。從制備噬斑開始到凝膠電泳，整個操作過程需約 6.5 h。

11. 通過免疫印跡檢測覆蓋液中的融合蛋白。若原始噬菌體是按方案 6 所述的方法分離的，則可用 DNA 結合實驗進行檢測。
在未感染的培養物或不含 IFTG 覆蓋液中是檢測不到免疫反應性及 DNA 結合性的。檢測酶活性時，分析前覆蓋液應用適當的緩沖液進行透析。

12. 利用試劑盒可通過親和層析純化覆蓋液中的β-半乳糖苷酶融合蛋白（如 Promega Proto Sorb), 或按第 15 章方案 1 中所述方法進行。純化蛋白質前應先對覆蓋液進行透析以除去 IPTG。