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WB 磷酸化蛋白曝不出條帶的時候，會特別沮喪，特別希望有人指點一二。CST 技術支持團隊總結了多年經驗和技巧，為您送出 13 條做好磷酸化蛋白 WB 的建議。
確定樣本中磷酸化蛋白的表達量
① 對的樣本，② 正確的處理方法，③ 合適的陽性對照是實驗成功的步。
① 實驗前需先查閱文獻或通過預實驗檢測該樣本是否表達，若該樣本根本就不表達目的蛋白，那就不要浪費感情了吧。
② 若正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達，可通過物理或化學方法進行一定的刺激和誘導，刺激條件各不相同。但這并不代表刺激越多越好，充分但不過分（如磷酸化 IRS1，僅需刺激 5 min，刺激過久會進入負反饋機制進而開始降解）的正確刺激會幫助得到*佳實驗結果。
③ 有合適的陽性對照至關重要，在任何實驗中，我們都應考慮包含適當的陽性和陰性對照，可使您進一步確定抗體檢測到的特異性信號。
總蛋白和內參對照都要做
普通的內參如 Actin、GAPDH 等和總蛋白抗體的對照都要做嗎？對，都要做！普通內參可以作為體系的對照，保證上樣量一致從而排除體系本身的影響，對于結果分析比對十分重要。
同時，總蛋白抗體也必不可少，僅僅是檢測到磷酸化蛋白表達量的增加并不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加了才能說明磷酸化水平增加，這種表述實驗結果的方法是*客觀的，也是必需的。
確保完全裂解并使用新鮮樣本
相對于僅用裂解緩沖液裂解，裂解液裂解 + 超聲處理可確保整個細胞充分裂解并剪切染色質 DNA。建議在 35%~40% 的功率輸出條件下超聲 3 次，每次 10 s。由于不同儀器不同性能，請根據生產商的建議進行優化。超聲處理時應保持低溫、冰上操作。如果您沒有探頭超聲儀，用細的注射器針頭反復吹打也能起到類似的作用。在得到樣品后，請不要反復凍融，建議 -80℃ 冰箱分裝保存。
小心蛋白殺手
組織或細胞裂解時會釋放出大量內源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導致不同于正常生理狀態的差異。因此，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，對于維護蛋白質的磷酸化狀態，非常重要。否則條帶很淺不說，結果可信度還不能保證。
樣品低溫處理
除超聲時保持低溫，在做磷酸化蛋白的整個實驗過程中都要保證低溫環境。磷酸化蛋白在室溫條件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制劑也很明顯。所以務必要保持低溫環境！
用 5% 脫脂牛奶的 TBST 室溫封閉 1 h
網絡上流傳的磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說法是沒有科學依據的。這一誤區的出現可能是由于實驗者使用了非實驗級奶粉引起的（國內許多奶粉含有磷酸酶等雜質）。
CST 建議轉膜后迅速在 TBS 中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉膜緩沖液，隨后使用 5% 脫脂牛奶（請使用實驗級的 #9999）的 TBST 室溫封閉 1 h，這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結合并降低背景。
另外應避免膜封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結合。封閉后在 TBST 中洗滌 5 分鐘。CST 建議所有抗體均應如此。CST 科學家生產驗證每一支上市的抗體的每一種應用，顯然更懂得如何讓抗體表現出*佳的狀態。
一抗稀釋液
請務必根據產品說明書中推薦的稀釋液稀釋一抗，不同產品有不同*佳稀釋液，采用 CST 推薦的一抗稀釋液并按標準 protocol 操作實驗，是您實驗成功的保證。
4℃ 過夜孵育一抗
抗原抗體之間是一種非共價的結合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會變弱，容易脫落，因此，首先保證 4℃ 的孵育條件非常重要。
其次要保證抗原和抗體相互磨合孵育的時間，磷酸化蛋白只占總量的極少部分，過夜可保證充分結合進而曝出更漂亮的條帶。哪怕不是磷酸化蛋白，CST 也推薦 4℃ 過夜孵育，讓結果呈現的一面。
洗膜條件
一抗和二抗均建議用 1*TBST（相對于 PBST 緩沖液，*終信號會更強）洗膜 3 次，每次 5 min。洗膜時間不宜過長或過短，過長會導致信號減弱（抗體從結合的位點脫落），過短則會導致背景深。
另外，洗膜的時候，盒子要比膜稍微大一圈，保證膜充分的在洗滌液中晃動，且建議單張洗膜而非幾張一起清洗。
二抗室溫 1 h 孵育
用 5% 牛奶的 1*TBST 稀釋的二抗（BSA 稀釋二抗會產生較高背景），室溫 1 h 孵育即可。
掌控好曝光或壓片時間
磷酸化蛋白檢測除了容易有雜帶外，還容易出現高背景。所以曝光或壓片的時候注意掌控好時間，時間太長會使得背景深，過短又會不容易曝出條帶或曝出條帶很淺，所以需要優化出適合自己靶蛋白和實驗體系的*佳曝光時間。
磷酸化和總蛋白抗體到底怎么孵育？
一般磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，所以如果樣品比較珍貴或有限的情況下，可以在壓完磷酸化抗體后，將膜 strip 后再壓總蛋白抗體，stripping 的時候注意溫度盡量控制在 50℃ 以內。不過 CST 的做法是建議在樣品充足的情況下同時跑兩塊膠，比 strip 得到的結果更可信。對于有條件的實驗室，可考慮做總蛋白和磷酸化蛋白的 In-Cell Western。
蛋白 Marker 很重要
做磷酸化蛋白 WB 時，除了目的蛋白的條帶外，還可能會出現一些非特異性條帶。所以在此情況下，請一定要根據 marker 大小進行比對，查看條帶的分子量。否則有可能會誤以為一些非特異條帶是自己想要的，分析半天走了冤枉路不說，還耗費了大量精力。
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