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技術文獻

抗體純化：deaesephadexa50柱層析法
閱讀次數：1392 發布時間：2022/6/14 13:45:01

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一、原理
deae-sephadex a-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠a-50）為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉變為OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點為pH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。pH7.2～7.4的環境中，酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG。

1、試劑
（1）鹽析提取的人γ球蛋白
（2）0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10%NaN3
（3）DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇（PEG）
（4）0.1M，PH7.4 PB（配制見鹽析部分）

2、器材
（1）層析玻璃柱（1.3×40cm），滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗（200目）
（2）普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導儀、抽濾裝置（包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶），PH計
（3）透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙
（4）量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等

3、操作步驟
（1）deae-sephadex a-50預處理　
稱deae-sephadex a-50（下稱a-50）5g，懸于500ml蒸餾水內，1h后傾去上層細粒。按每克a-50加0.5mol/l naoh 15ml的比例，將a-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/l HCl同上操作過程處理，后以0.5mol/l NaOH 再處理一次。處理完后，將a-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中過夜。

（2）裝柱
①將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。
②將0.1mol/l ，pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的a-50。等a-50。等a-50凝膠沉降2～3cm高時，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時連續倒入糊狀a-50凝膠至所需高度。
③關閉出水口，待a-50凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

（3）平衡
啟開出水口螺旋夾，控制流速12～14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強度，兩者達到一致時關閉出水口，停止平衡。

（4）加樣及洗脫
啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品（體積應<床體積2%，蛋白濃度以<100mg為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2～3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12～14滴/min。

（5）收集
開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

（6）測蛋白
以751型紫外分光光度計分別測定每管OD 280nm，與OD 260nm，按公式計算各管蛋白含量。并以OD 280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。

（7）合并、濃縮
將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以peg（mw6000）濃縮至所需體積，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存備用。長期保存時應貯于-40℃冰箱。

（8）a-50凝膠的再生　
在柱上先以2mol/l NaCl洗脫蛋白至流出液的OD 280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將a-50再處理一遍即達到再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存；近期不用時，以無水/酒精洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內保存。

二、注意事項
1、柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
2、純化過程必須嚴格控制緩沖液的pH及離子強度。樣品與a-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進行柱層析。
3、所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。
4、洗脫過程中應嚴格控制流速，切勿過快。
5、上樣的體積要小，濃度不宜過高。
6、加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司