技術(shù)文獻(xiàn)
一、物理性狀的質(zhì)量控制
應(yīng)包括20℃ -25 ℃時(shí)的pH,并應(yīng)觀察以下內(nèi)容：加入培養(yǎng)基的量和(或)瓊脂層的厚度、顏色、透明度、是否存在肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)、凝膠穩(wěn)定性/黏稠度(一致性)、濕度。
滅菌后都應(yīng)測(cè)定pH,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電測(cè)定液體培養(yǎng)基的pH，固體培養(yǎng)基可用平頭電或者連接微型探頭的電測(cè)定pH,測(cè)量時(shí)盡量使培養(yǎng)基溫度降到20℃-25 ℃，校正通常用接近40 g/L的氫氧-化鈉或者1 mol/L的鹽酸。
二、微生物的質(zhì)量控制
1.污染檢測(cè)
在每批制備好的培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)選取部分樣品進(jìn)行污染測(cè)試。
2.質(zhì)控菌株
質(zhì)控菌種應(yīng)具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效地證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基的佳性能。測(cè)試菌種應(yīng)可溯源至國(guó)家或公認(rèn)的菌種收藏中心，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己分離的具有良好特性的菌種，但必須對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢測(cè)和記錄儲(chǔ)存菌株(stock culture)的相關(guān)特性，新復(fù)蘇的菌種可能會(huì)有非特異性反應(yīng)。好使用從食品中分離的菌種。
培養(yǎng)基的質(zhì)控菌種應(yīng)具備以下性能：具典型反應(yīng)的強(qiáng)陽(yáng)性菌種；弱生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌種(選擇更敏感的菌種);無(wú)生化反應(yīng)的菌種；完全抑制菌種。
3.質(zhì)控方法
食品微生物委員會(huì)和培養(yǎng)基菌種衛(wèi)生工作組(WPCM)介紹了培養(yǎng)基評(píng)估用測(cè)試菌種的有效收集方法。
(1)即用培養(yǎng)基和試劑
商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠家如果經(jīng)過(guò)IS0 9001和ISO 9002體系認(rèn)證或滿足相應(yīng)質(zhì)量要求，應(yīng)向使用方提供資質(zhì)證明。這時(shí)，使用者就不必對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行大量的測(cè)試工作，但必須保證其儲(chǔ)存條件。
(2)采用商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基
按ISO/TS 11133-1: 2009 《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué) 培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》的要求，除了對(duì)每批制備好的培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測(cè)試外，還應(yīng)用實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，以更好地保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。對(duì)于不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，只需用陽(yáng)性測(cè)試菌種進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，必須使用能證明其指示或選擇作用的菌種進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于復(fù)合培養(yǎng)基，即需要加入添加成分的培養(yǎng)基，要用具備上述性能的菌種逐批進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的需加入添加成分的制成培養(yǎng)基同樣適用。
(3)按照培養(yǎng)基配方制備的培養(yǎng)基
建議除了按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)基品質(zhì)測(cè)試外，還要用改良的Miles-Misra技術(shù)、螺旋平板技術(shù)或菌落總數(shù)技術(shù)進(jìn)行測(cè)試，以監(jiān)控基礎(chǔ)材料的質(zhì)量、培養(yǎng)基性能和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的配制規(guī)范。實(shí)際上，食品中包含有應(yīng)激反應(yīng)的微生物，還應(yīng)考慮到培養(yǎng)基在應(yīng)激細(xì)菌恢復(fù)方面的適用性。
三、培養(yǎng)基性能測(cè)試方法
實(shí)驗(yàn)室可采用半定量和定量技術(shù)對(duì)固體、液體培養(yǎng)基的性能進(jìn)行測(cè)試，在多數(shù)情況下能滿足對(duì)培養(yǎng)基性能測(cè)試的要求。
對(duì)于特殊情況，如評(píng)價(jià)一種新的培養(yǎng)基或一個(gè)新的生產(chǎn)商的產(chǎn)品等，應(yīng)采用定量測(cè)試法。
1.固體培養(yǎng)基
應(yīng)用于固體培養(yǎng)基質(zhì)控程序的技術(shù)大都依靠菌落計(jì)數(shù)。主要應(yīng)用的技術(shù)有：傾注法、涂布法、旋轉(zhuǎn)涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。這些方法作為食品實(shí)驗(yàn)室的日常方法得到了國(guó)/際公認(rèn)。由于傾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中經(jīng)常使用，這里不再介紹，著重介紹一下改良的Miles -Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。
(1)改良的Miles-Misra方法
改良的Miles-Misra方法是通過(guò)測(cè)試培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率(productivity ratio, PR)來(lái)檢查培養(yǎng)基的性能，通常與對(duì)照培養(yǎng)基相比。對(duì)照培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)是富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如：胰酪胨大豆瓊脂。
該方法步驟如下：
①將試驗(yàn)菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物用緩沖蛋白胨水10倍梯度稀釋。
②將試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基做成4 mm厚的平板，并使平板表面干燥。
③從高稀釋度(如10-5)開(kāi)始，分別滴1滴稀釋液于試驗(yàn)平板和對(duì)照平板標(biāo)記好的區(qū)域。
④每個(gè)稀釋度各取4滴分別加入4個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基，每1滴的涂布超過(guò)四分平板，并用涂布器從高稀釋度開(kāi)始涂布， 37 ℃培養(yǎng)18h。
⑤對(duì)數(shù)量和菌落形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
評(píng)價(jià)方法，即按下列方式計(jì)算：
PR=Ns/No
式中：
PR－－生長(zhǎng)率；
Ns-試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落數(shù)；
No-對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)。
示例：在10-3稀釋度，試驗(yàn)培養(yǎng)基上為20個(gè)菌落，對(duì)照培養(yǎng)基上為25個(gè)菌落，則PR=0.80。
(2)半定量劃線法
使用本方法時(shí)，所有測(cè)試培養(yǎng)基應(yīng)干燥到相同程度，且整個(gè)步驟應(yīng)標(biāo)注化，以便于比較同批次培養(yǎng)基的測(cè)試結(jié)果。
用1 uL接種環(huán)劃線平板。在A區(qū)用接種環(huán)按0.5 cm的間隔劃4條平行線，按同樣的方法：B區(qū)和C區(qū)劃線，后在D區(qū)內(nèi)劃一條線。按標(biāo)準(zhǔn)方法所規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
通常情況下用同一接種環(huán)對(duì)A區(qū)~D區(qū)進(jìn)行劃線，在不同區(qū)域劃線時(shí)不需對(duì)接種環(huán)滅菌。但為了得到低生長(zhǎng)指數(shù)G1, ,在A區(qū)和B區(qū)接種應(yīng)更換接種環(huán)或?qū)ζ溥M(jìn)行滅菌。
評(píng)價(jià)方法：培養(yǎng)后，評(píng)估菌落的形狀、大小和密度，并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)G1。每條有菌落生長(zhǎng)的劃線記作1分，每個(gè)培養(yǎng)皿上多為16分。如果僅一半的線有菌落生長(zhǎng)，記作0.5分。如果劃線上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)量少于劃線一半，則記作0分。記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G1。例如：菌落在A區(qū)和B區(qū)全部生長(zhǎng)，而在C區(qū)有一半線生長(zhǎng)，則G1為10。
目標(biāo)菌的生長(zhǎng)指數(shù)G1大于6時(shí)，則判定培養(yǎng)基可接受。非選擇性培養(yǎng)基的G1值通常更高。目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長(zhǎng)，而非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)應(yīng)部分或完全被抑制。
(3)定性劃線法
該方法只是定性測(cè)試，劃線培養(yǎng)后，按照要求進(jìn)行打分，得分是指示性的，可用作固體培養(yǎng)基性能測(cè)試的補(bǔ)充。
取1uL測(cè)試菌株培養(yǎng)物在測(cè)試培養(yǎng)基表面劃平行直線，可同時(shí)在一個(gè)平板上接種多個(gè)菌株，但劃線不能交叉，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
評(píng)價(jià)方法：培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行平板生長(zhǎng)評(píng)估： 0表示無(wú)生長(zhǎng)， 1表示生長(zhǎng)， 2表示良好生長(zhǎng)。目標(biāo)菌得分應(yīng)為2,并且有典型的菌落外觀、大小和形態(tài)。非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)應(yīng)該部分或全部被抑制。
2.液體培養(yǎng)基
為確定液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率，應(yīng)接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物。下面介紹的是用定量、半定量和定性方法評(píng)估生長(zhǎng)率和選擇性的方法。所推薦的這些方法都是通過(guò)將液體培養(yǎng)基以傾注或劃線方式接種到瓊脂平板上培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)或計(jì)算液體培養(yǎng)基分?jǐn)?shù)而得出其生長(zhǎng)數(shù)量的。對(duì)于液體培養(yǎng)基定性測(cè)試方法，則通過(guò)肉眼觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)。
目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的定量稀釋法步驟如下：
選擇液體培養(yǎng)基10 mL/管待檢。
接種目標(biāo)菌：將少量測(cè)試菌株培養(yǎng)物(每管10 CFU~100 CFU)接種測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。
接種非目標(biāo)菌：將大量測(cè)試菌株培養(yǎng)物(每管大于1000 CFU)接種測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。
接種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合培養(yǎng)物：用少量目標(biāo)菌(每管10 CFU ~100 CFU)測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯。同時(shí)每管接種大量非目標(biāo)菌(每管大于1000 CFU),混勻。
稀釋劑和運(yùn)輸培養(yǎng)基中目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的接種：接種測(cè)試菌于稀釋劑中(每管100 CFU~ 1000 CFU),混勻。
按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果的計(jì)算和解釋：
(1)計(jì)算目標(biāo)和非目標(biāo)微生物的菌落數(shù)，用生長(zhǎng)率(PR)和選擇因子(SF)進(jìn)行結(jié)果的解釋。
目標(biāo)微生物的PR不應(yīng)小于0.1 (因生長(zhǎng)的不同不能超過(guò)1個(gè)數(shù)值)，非目標(biāo)微生物的SF至少應(yīng)達(dá)到2。
SF的計(jì)算見(jiàn)式 :
SF=Do-Ds
式中：
Do-在參考培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)至少10個(gè)菌落的高稀釋度；
Ds-在測(cè)試培養(yǎng)基上顯示相應(yīng)生長(zhǎng)的高稀釋度；
SF、Do和Ds用Ig表示。
例如：Do=lg104=4.0, Ds=lg103=3.0,選擇因子SF=1.0。
混合菌株中， 目標(biāo)菌的生長(zhǎng)不應(yīng)受到非目標(biāo)菌的抑制，即目標(biāo)菌始終應(yīng)為優(yōu)勢(shì)菌群。
(2)在混合菌株中目標(biāo)菌數(shù)量的低值及非目標(biāo)菌數(shù)量的高值應(yīng)符合以下要求：目標(biāo)菌的低濃度應(yīng)達(dá)到10CFU/mL ~10CFU/mL;在選擇性肉湯培養(yǎng)物中非目標(biāo)菌的高濃度不應(yīng)超過(guò)104 CFU/mL.
(3)稀釋和運(yùn)輸培養(yǎng)基不應(yīng)引起目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌數(shù)量的減少或增加。菌株在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的數(shù)量變化應(yīng)在初計(jì)數(shù)的±50%的范圍內(nèi)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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