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技術文獻

簡述堿性磷酸酶標抗體制備技術的標記步驟
閱讀次數：535 發布時間：2025/6/3 9:53:47

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堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，由多個同功酶組成。從小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kDa，酶作用的適pH為9.6；從大腸桿菌中提取酶分子量為80kDa，適pH為8.0。它的作用底物較多，常用的酶底物有對硝基本磷酸鹽（PNP）、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。AP主要用作雙標記染色，研究遞質共存及酶免疫測定。AP標記抗體，一般采用戊二醛作交聯劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個醛基結合。

堿性磷酸酶標抗體制備技術的標記步驟

（1）取抗體（2～5mg/mL）1mL，加入AP5mg溶解。

（2）裝入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，換液3次。

（3）加入2.5%戊二醛20uL，室溫（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析過夜，換液3次。

（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液中，4℃透析過夜，換液3次。

（5）取出標記抗體，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl緩沖液稀釋至4mL，即為酶標記物原液。

（6）加入1/3量純甘油，測定工作效價后，小量（0.1mL）分裝，4℃保存（使用以pH7.4PBS-吐溫溶液將結合物適當稀釋）。

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司