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技術(shù)文獻(xiàn)

【解決方法】瓊脂糖凝膠電泳常見(jiàn)問(wèn)題
閱讀次數(shù)：1421 發(fā)布時(shí)間：2025/3/17 9:53:40

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瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳常見(jiàn)為題都有哪些？

DNA帶模糊

DNA降解：瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)中要避免核酸酶污染

電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多系使用后，離子強(qiáng)度降解，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳實(shí)驗(yàn)，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。

所用電泳條件不合適：電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度<30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)該<15℃；檢車(chē)所有電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力

DNA上揚(yáng)量過(guò)多：應(yīng)減少凝膠中DNA上樣量。

DNA樣含鹽量過(guò)高：電泳通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽。

有蛋白污染：電泳酚抽提去除蛋白

不規(guī)則DNA帶遷移

對(duì)于λ/HindⅢ片段cos位點(diǎn)復(fù)性：電泳于65℃加熱DNA5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。

電泳條件不合適：電泳電壓不超過(guò)20V/cm；溫度<30℃；經(jīng)常更換電泳緩沖液。

DNA變性：以20mM NaCI Buffer稀釋DNA，電泳勿加熱。

帶弱或無(wú)DNA帶

DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。

DNA降解：避免DAN的核酸酶污染

DNA走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。

對(duì)于EB染色的DNA，所用光源不合適：應(yīng)用短波長(zhǎng)（254mm）的紫外光源

DNA帶缺失

小DNA帶走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。

分子大小相近的DNA帶不易分辨：增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。

DNA變性：電泳請(qǐng)勿高溫加熱NDA鏈，以20mM NacI Buffer稀釋DNA

DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適：在脈沖凝膠電泳上分析。

綜上所訴，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需注意以下幾點(diǎn)：

1.體系配制時(shí)候關(guān)鍵的幾個(gè)試劑一定要確定它們還有效、或者還沒(méi)被污染：引物，酶，超純水。這些東西好自己收好，寫(xiě)上個(gè)人的名字放好，冰盒上記得帶上橡皮筋，這樣就不會(huì)因?yàn)閯e人翻冰箱時(shí)候把你的冰盒碰散了，試劑都碰掉。否則，你的試劑被污染了，到時(shí)候陰性對(duì)照狂出條帶，再去找污染源很麻煩。而且配置體系時(shí)候要注意保持實(shí)驗(yàn)區(qū)的干凈，事先可用小噴壺進(jìn)行酒精噴霧，固定空氣中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染體系。

2.pcr體系要摸準(zhǔn)，好用人家都做得很多的老體系來(lái)上手。

3.要想得到漂亮的電泳圖，可以在PCR開(kāi)始時(shí)候就把膠倒上（提是PCR總時(shí)間在1.5小時(shí)左右，并且1.5小時(shí)候之后你還在實(shí)驗(yàn)室。），讓凝膠涼著，這樣凝膠的上樣孔會(huì)比較規(guī)則，膠體里面的其本身的孔徑也會(huì)較規(guī)則。如果要第二天再跑膠，千萬(wàn)記得把PCR完畢的樣本放入4℃保存。第二天做時(shí)候建議把膠涼上25分鐘左右。

4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時(shí)候建議使用排槍上樣，不僅快速而且樣本加到膠孔里的速度一致。當(dāng)然，排槍上樣好選用進(jìn)口槍頭。

5.不管電泳室使用的頻率高還是低，建議每次瓊脂糖凝膠電泳時(shí)候更換電泳液，避免出現(xiàn)“＾”形條帶。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司