免疫熒光試驗定義一種免疫標記技術。用于檢測相應抗原或抗體。即用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中的抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原進行鑒定或定位。
⑴基本原理染色程序分為兩步，第1步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第1步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。
⑵試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋。
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實驗步驟1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。
2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。
4）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
6）重復操作3。
7）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8）熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。
⑷注意事項1）熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2）每次試驗時 ，需設置以下三種對照：
① 陽性對照：陽性血清+熒光標記物
② 陰性對照：陰性血清+熒光標記物
③ 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色 。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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