技術(shù)文獻(xiàn)
用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法
1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系
對(duì)大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對(duì)于基因過表達(dá)，如果轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%，基因過表達(dá)尚可。但是對(duì)于基因干擾實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過表達(dá)，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。
另外，質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中，很快降解，無法滿足較長時(shí)間的檢測(cè)項(xiàng)目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率低，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時(shí)耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。
2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高/效，是目主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，由于其高/效整合、高/效轉(zhuǎn)錄、高/效表達(dá)、宿主范圍廣，感染效率高，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株服務(wù)流程
1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
2、篩選濃度測(cè)定：以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
3、細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋。
4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。
5、抗生素篩選。
6、鑒定篩選結(jié)果。
終交付
1、病毒滴度檢測(cè)報(bào)告；穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；
2、結(jié)題報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程，測(cè)序結(jié)果和峰圖、引物序列、載體圖譜和滴度測(cè)定報(bào)告和q-P
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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