技術(shù)文獻
細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。然而，細(xì)胞株在體外培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)一些問題，比如：細(xì)胞株無法在培養(yǎng)皿上貼壁生長，細(xì)胞株生長緩慢，細(xì)胞株死亡等。那么該如何解決呢？
一、細(xì)胞株無法在培養(yǎng)器皿上貼壁生長
1.細(xì)胞株胰酶消化過度：縮短胰酶消化時間或減少胰酶用量。
2.支原體污染：隔離細(xì)胞株，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞株被污染，滅菌處理后丟棄。
3.培養(yǎng)基中無附著因子：如果使用的是無血清配方，應(yīng)確保含有附著因子或者使用經(jīng)過包被的培養(yǎng)板。
二、細(xì)胞株生長緩慢
1.培養(yǎng)基或血清改變：比較不同培養(yǎng)基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有無差異；通過生長實驗比較新老批次血清有無差異；增大細(xì)胞株初始接種密度；使細(xì)胞株逐步適應(yīng)新的培養(yǎng)基。
2.必需生長促進成分（如L-谷氨酰胺或生長因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中添加生長促進成分（如L-谷氨酰胺）。
3.輕度細(xì)菌或真菌污染：在不添加抗生素的條件下進行培養(yǎng)，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。
4.時間存儲不當(dāng)：血清應(yīng)于-5℃至-20℃下儲存；培養(yǎng)基應(yīng)于2℃~8℃下避光儲存；盡量減少血清和培養(yǎng)基見光時間。
5.細(xì)胞株初始接種密度低：增大活細(xì)胞接種密度。
6.細(xì)胞株衰老、老化：將老化細(xì)胞丟棄，取用代數(shù)較少的細(xì)胞。
7.支原體污染：隔離細(xì)胞株，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。
三、培養(yǎng)基pH值變化迅速
1.培養(yǎng)箱CO2分壓設(shè)置錯誤：根據(jù)培養(yǎng)基中NaHCO3的濃度增大或降低培養(yǎng)箱CO2的分壓，NaHCO3濃度為2.0-3.7g/L時，應(yīng)相應(yīng)地使用5%-10%的CO2分壓。
2.細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋過緊：將瓶蓋旋松1/4圈。
3.碳酸氫鹽緩存系統(tǒng)緩沖能力不足：加入HEPES緩沖液，使其終濃度為10-25mM。
4.培養(yǎng)基中鹽含量不正確：CO2平衡環(huán)境中使用以Earle平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hanks平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基。
以上就是細(xì)胞株在培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的問題、原因以及解決方法，希望可以幫助大家在培養(yǎng)細(xì)胞株過程中遇到的困難，僅供參考。
5.細(xì)菌、酵母或真菌污染：將細(xì)胞和培養(yǎng)基滅菌處理后丟棄。
四、細(xì)胞株凋亡
1.培養(yǎng)箱中無CO2：監(jiān)測培養(yǎng)箱中CO2使用速度以便確定及時更換氣瓶；經(jīng)常檢測管路連接處是否漏氣；不要頻繁開啟培養(yǎng)箱門。
2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度有波動：監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，及時校正。
3.使用抗生素達(dá)到毒性濃度：減少抗生素的用量；使用無血清培養(yǎng)基時，抗生素濃度應(yīng)降低至1/10。
4.細(xì)胞株復(fù)蘇或凍存時受到損傷：取用新的細(xì)胞。
5.培養(yǎng)基的滲透壓不合適：檢查完/全培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞可耐受260~350mOsm/kg的滲透壓，加入某些試劑和藥物后會影響培養(yǎng)基的滲透壓；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓（340~380mOsm/kg）要高于哺乳動物細(xì)胞。
6.培養(yǎng)基中毒性代謝產(chǎn)物蓄積：去除原培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基。
五、懸浮細(xì)胞株集成團
1.存在鈣離子和鎂離子：用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。
2.支原體污染：隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。
3.蛋白水解酶消化過度導(dǎo)致細(xì)胞裂解、DNA釋放：用0.001%DNA酶I處理細(xì)胞；用PBS沖洗后再接種到新培養(yǎng)基中。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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