細胞培養是一項艱難的工作。因為這是一個高度技術性的過程，當你從一個來源提取細胞并在另一個條件下去對他們進行操作時，可能會出現很多問題，比如受到外界的污染，或者生長速度非常緩慢。
但其中也有許多是我們可以去控制的。在過去的100多年里，貼壁細胞培養實驗為現代醫學的一些/具革命性的進/步做出了貢獻，促進了我們對癌癥等疾病的理解，并支撐了安全有效的治療方法的發展。
幸/運的是，現在人們對細胞培養的了解比20世紀初體外培養先驅羅斯·哈里森（Ross Harrison）在玻片上分析青蛙組織時多得多。下面跟著遠慕一起來看看培育活細胞的基本知識，包括如何接種、增殖和收獲。
低溫狀態下的細胞接種在購買細胞培養品系時，產品是冷凍保存的，這對長/期保持細胞活力是必要的。在這種狀態下，你需要解凍并進行細胞接種，這個過程應當是非常謹慎小心的，即便它發生得很快。然而，這一重要的步驟的經常匆忙進行，有時很多細節甚至被忽視，這就存在了細胞被污染的風險，也沒有給細胞提供它們所需要的良好的、無菌的開始。
以下是進行細胞接種的正確方法：準備好所需的所有的器具。你需要一個冷凍的小瓶子、一個燒杯或水浴槽，裝滿預熱的水，和一個裝有預平衡介質的燒瓶。如果你打算降低細胞的活躍度并去除DMSO或其他低溫保護劑，你還需要一個錐形瓶用于盛裝這些介質。
加熱小瓶子。在裝有預熱過的水的燒杯中輕輕攪動冷凍的小瓶子，直到里面的組分幾乎完/全融化。然后，用酒精濕巾清潔小瓶，以減少被污染的風險。
接種細胞。使用移液管，從冷凍液中取出細胞并轉移到燒瓶中。然后用移液器反復吸取混勻溶液，以便接種。這樣，你的細胞就會被解凍、轉移、并準備好進入培養箱（或用于去除DMSO的離心機）。
細胞數量隨著細胞增殖而擴大當細胞生長到一定密度后，需要對細胞進行分離傳代。你需要掌握正確的細胞分離方法。細胞增殖是細胞培養的必要部分，依賴于效率和一致性。如果使用的工作流程效率低下，可能會提高供應和人工成本；如果遵循了后不一致的工作流程，則可能會給您的細胞帶來過度壓力，并殺死它們。
達到目的的方式取決于你的對于實驗容器的選擇。市面上有非常多的選擇，比如使用i-Quip?容器，可以幫助生命科學家在更小的空間中建立友好的環境，以實現更快的生長，也更多的減少勞動力和污染風險。
因為不是所有的容器都具有相同的生長面積，研究人員通常會考慮細胞/cm2的產量來決定他們的容器選擇和相關試劑的用量。然后，他們將利用這一技術持續地進行細胞接種實驗，使其達到研究人員所需的細胞數量。為了獲得/佳生長/效果，通過以下操作保持細胞/cm2和mL/cm2的比例穩定來選擇容器和試劑：
使用這個公式來計算您的細胞數量，以容器為單位：[(所需細胞/cm2)×(容器的面積cm2)]；
應用這個公式來計算每個容器所需的試劑量：[(期望mL數/ cm2)×(容器的面積cm2)]。為了達到/佳的細胞生長和氣體擴散，大多數情況下每cm2的細胞生長面積將需要0.2 mL到0.5 mL的培養基。
收獲你的貼壁細胞當細胞在顯微鏡下呈現為單層時，你就知道它們已經準備好被收獲了。實驗員們一般會通過化學或物理手段分離細胞。
一種方法是通過解離試劑進行化學分離，需要針對細胞類型和應用進行優化，以確保細胞不受試劑的負面影響。相比之下，對于可能不耐受解離試劑的強黏附、敏感細胞，通過細胞刮除器進行物理清除可能是更好的方法。同時還需要考慮下游應用場景，以及如何或是否解離試劑可能影響您的研究。
如果您選擇使用解離試劑，請使用移液管無菌地遵循以下操作步驟：
從培養瓶中取出培養基；向培養瓶中加入PBS等緩沖溶液，以去除可能干擾解離劑的任何微量血清。輕輕搖動容器，使里面的溶液均勻。浸泡10到15分鐘以分離哪些難以分離的細胞系。移去緩沖液；
以0.02到0.03 mL/cm2的比例添加解離試劑。根據細胞系或解離試劑的特性，在37℃孵育可以促進解離；
當細胞狀態呈現圓形，但還沒有開始聚集時，它們就已經準備好了——就好像你在看一個充滿了成千上萬顆星星的夜空。溶液開始變得渾濁是一個好跡象，表明它們已經準備好被分離了；
用緩沖液或含血清的培養基稀釋解離試劑，通常以1:1的比例稀釋。在去除整個溶液并將其轉移到試管內之，上下吸取幾次以混勻；
如果細胞對試劑特別敏感，則建議通過離心法實現細胞的分離。
現在你的細胞可以計數了，同時也可以對其細胞密度和活力進行測量了。
通過細胞培養達成你的研究
貼壁細胞培養可以為你的實驗室打開一個實驗和下游應用的全/新——它同樣也可以很有趣。但當你操縱活體細胞時，可能會有很多風險，所以正確的操作非常重要。通過遵循這些基本的指示，并努力達成更完善的操作流程，你可以逐步成長為一個細胞培養家。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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