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1.儀器用具：

（1）恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；

（2）高速冷凍離心機(jī)及離心管（使用20,000 rpm離心陀）；

（3）液態(tài)氮及冰筒；

（4）37℃水浴鍋

使用高速離心機(jī)要注意： 離心機(jī)及離心陀的溫度要預(yù)冷完全，相對(duì)位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉(zhuǎn)速絕對(duì)不能超過(guò)速限；

2.藥品試劑：

（1）轉(zhuǎn)型菌株pQG11/M15 [pREP] 單一菌落；

（2）LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；

（3）Lysis buffer （50 mM Na₃PO4·12H₂O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100）。使用前添加成：10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme；

（4）Buffer A（50 mM Na₃PO₄, pH 7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成為10 mM *終濃度；

（5）Buffer B： Buffer A 再加入0.15 M NaCl；

（6）硫酸銨 （要烘干并以研砵磨碎）。

3.方法步驟：

（1） 挑取培養(yǎng)皿上單一菌落，培養(yǎng)在15 mL 的LB/amp/kan 液體培養(yǎng)基中，以120rpm 轉(zhuǎn)速震蕩，在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。

（2） 取上述菌液6 mL加入300 mL新鮮LB/amp/kan培養(yǎng)基中，以120 rpm 37℃培養(yǎng)至A₆₀₀ = 0.6 后，加入IPTG成為1 mM濃度，繼續(xù)以120 rpm在37℃震蕩培養(yǎng)4 h。

（3） 將菌液倒入50 mL 離心管（conical tube）中離心10 min （5,000 rpm）。

（4） 倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃冰箱貯存。

（5） 取出含菌塊的離心管置碎冰上，待菌塊溶解后，以殘存液體均勻懸濁的。再加入10 mL lysis buffer 輕輕懸浮的。

（6） 將菌液放在液態(tài)氮中冷凍1 min，然后在37℃水浴中搖蕩溶解的。如此反復(fù)三次，盡量不要產(chǎn)生大量氣泡。將離心管的內(nèi)容物倒入50 mL 高速離心機(jī)的離心管內(nèi)。

（7） 離心20 min （12,000 rpm, 4℃） 取上清共 _____ mL,稱(chēng)為 粗抽取液 （XT）；預(yù)留100 μL 以便日后一起進(jìn)行分析。此后樣本均得放置碎冰上，以低溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（8） 此上清加入5 mL buffer A 混勻后倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時(shí)攪拌并緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm，使成為70%飽和度，加完后再攪拌10 min。

（9） 離心20 min（12,000 rpm, 4℃）后小心倒去上清，取白色沉淀部份。

（10） 沉淀加以2 mL buffer B均勻懸濁的，再以桌上型離心機(jī)去除不溶物質(zhì)，（10,000 rpm,5 min），共得 ______ mL，稱(chēng)為 全蛋白質(zhì)（TP）；預(yù)留100 μL，連同上述XT 置4℃冷藏。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司