技術文獻
2014年，人類蛋白質組草圖繪制完成，這是繼人類基因組計劃之后第二個生命科學的里程碑，為人們深入了解疾病狀態下的機體變化奠定了基礎。中國人類蛋白質組計劃近兩年也陸續公布了階段的成果，有望揭示腫瘤的分子機制和治療靶點，推動了精準醫療的新浪潮。
質譜（Mass Spectrometry, MS）已成為蛋白質檢測和鑒定的方法。質譜儀的準確性、靈敏度和靈活性實現了生物研究、生物制藥和診斷檢測方面的新應用。不過，由于蛋白質組非常復雜，制備質譜分析所用的蛋白質樣品尚無標準方法。那么，在樣品處理時需要注意什么呢？
明確樣品類型
針對不同類型的樣品，比如細胞、組織、體液（包括血清、血漿、尿液和腦脊液等），前處理方法是不同的。在設計具體的樣品制備策略時，我們應當考慮多個因素，包括樣品類型、蛋白質的各種性質以及它在細胞中的定位。針對這些因素進行優化，才能產生靈敏而可靠的結果。
需要注意的是，蛋白質往往以不同的量存在，而高豐度蛋白會掩蓋低豐度蛋白的信號。血液樣品中就含有大量干擾的高豐度蛋白（比如血清白蛋白和免疫球蛋白），影響了生物標志物的檢測。
傳統切膠去除法操作麻煩、效率極低且重復性很差，逐漸被淘汰。利用色譜柱和液相去除的方法雖然效果還可以，但時間冗長，很難實現多個樣品同時操作。近年來基于離心柱形式的高豐度蛋白去除試劑盒越來越受歡迎。遠慕生物也提供了以下三種產品。
樣品處理方法
質譜分析前的樣品處理是一個復雜的過程。在富集目標蛋白或研究蛋白定位時，可能需要行亞細胞蛋白組分分離。之后可采用基于蛋白序列、抗體表位、翻譯后修飾（PTM）或活性位點結合等多種不同的技術對蛋白質進行富集。這是分離低豐度蛋白或降低樣品復雜度的必經步驟。
之后還要進行變性、還原、烷基化、除鹽、純化、再除鹽等一系列冗長的步驟，不過目前市場上也有商品化的快速處理試劑盒，能夠將處理時間從2天*快縮短到3小時。比如，遠慕生物的EasyPep Mini MS樣品制備試劑盒利用預先配制的緩沖液、質譜級的酶混合物以及多肽純化柱來處理哺乳動物細胞和組織，不到3小時就可以生成與質譜兼容的多肽樣品。
圖1. 傳統方法與優化試劑盒的對比
多肽定量
正如western blot電泳之前對蛋白裂解液進行定量一樣，質譜上機前也必須對酶解后的多肽進行定量，以便優化蛋白樣品/蛋白酶的比例。此外，串聯質譜標記（TMT）的上游也建議要測定蛋白/肽段的濃度，以確保在混合之前用于標記的樣品是完全等量的。
由于大多數的蛋白定量方法在檢測酶解后的肽濃度時不夠靈敏，推薦使用易用型的Pierce比色法或熒光法肽段定量試劑盒進行肽段濃度測定，這兩款試劑盒是專為提高肽段混合物定量的靈敏度和重復性而設計的。顯色法肽段定量試劑盒 可以兼容后續的TMT定量。熒光法肽段定量試劑盒 一般不能兼容后續的TMT定量。
多肽標記
根據樣品類型和是否需要標記，一般有如下幾種標記選擇。串聯質譜標記（TMT）和代謝氨基酸標記（SILAC）可以實現多個樣品的質譜分析，增加樣品通量，對來自細胞、組織或體液的2-10個不同樣品進行相對定量。TMT因為其能實現多至11標的高通量，且定量穩定，所以成為目前市面上*常用的定量蛋白組學方法。
多肽富集和組分分離
低豐度蛋白的成功分析和磷酸化肽段的鑒定往往離不開這幾步：富集、分離和/或純化。在細胞裂解液中，許多磷酸化肽段以極低的水平存在。您可以根據研究方向選擇富集方式，如果要富集磷酸化肽段，基于Fe-NTA 和 TiO2的方法是主流，一般用富集率和鑒定率來衡量質量。
研究人員曾用遠慕High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽段富集試劑盒對3份293T 細胞裂解液進行重復試驗，三次重復的磷酸化肽段富集效率均在高達97%以上，且共鑒定出10,898條多肽信息，鑒定率均在50%以上。
由于每種配體的結合性質不同，如果將Fe-NTA 和 TiO2的方法連用，可以實現磷酸化多肽的富集效率和覆蓋度。
對于組分分離，除了傳統的液相系統外，您還可以采用離心柱形式的高pH反相多肽離心柱。Pierce高pH反相多肽分離試劑盒包含高pH值的溶液（0.1%三乙胺）和12支離心柱，結合離心機使用只需1小時即可完成分離，且可以同時實現多個樣品的高通量操作。
多肽脫鹽純化
上機前的*后一步就是要保證多肽經過脫鹽純化，脫鹽不充分不僅會影響目的肽段的鑒定，而且容易損壞儀器。此時可使用反相（RP）樹脂來去除鹽和緩沖液，其中C18基質是用于捕獲疏水肽的理想基質。多肽在高水相流動相中與反相柱結合，同時鹽和緩沖液被洗去，然后用高有機相流動相洗脫多肽。Pierce™ C18系列不僅提供了適合大體積樣本的離心柱（column），還提供了適合小體積樣本的吸頭（tip）。
總而言之，質譜上機前的樣品制備流程環環相扣，每一步若質量不達標都會影響整體檢測結果。為了幫助科研工作者從復雜的流程中解放出來，遠慕致力于研發和拓展質譜兼容的產品和技術，為蛋白質組學研究提供整體解決方案。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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