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Nk 細胞又稱自然殺傷細胞，是人體內抗癌活性*強的免疫細胞，它在骨髓中發育成熟后，主要存在于外周血、肝臟、腹膜腔和胎盤中，在遇到腫瘤病變細胞時就會把它們殺死，同時也會刺激身體產生抗腫瘤的免疫反應，所以被醫學界稱為「抗癌的道防線」。



NK 細胞主要分布于外周血，占外周血淋巴細胞總數的 5-10％，無需抗原提呈細胞作為中介提呈抗原，也無需抗體幫助，可直接清除衰老細胞、變性細胞、癌細胞及病毒感染細胞等。NK 細胞屬于白細胞的一種，它是人體忠誠的衛士，主要任務就是消滅那些已經被病毒感染的細胞，從而把病毒消滅在「搖籃」中。另外，身體里面的腫瘤細胞也是它們追殺的對象。
NK 細胞在機體免疫監視和早期抗感染免疫過程中起到非常重要的作用，是一種有效、安全的腫瘤生物免疫治療方法，具有廣闊的應用前景。

 

分離培養 NK 細胞有多種方法，以下是采用某種試劑盒的因子法體外培養方法來培養 NK 細胞：
這種方法采用自體外周血細胞中分離得到的單個核細胞，經體外操作使 NK 細胞擴增活化，通過激活體 內特異性免疫反應達到殺火腫瘤細胞目的的一種體細胞治療方法。

 

1. 某 NK 細胞培養試劑盒包含：
①無血清培養基 2 瓶（l000 mL/瓶）：
②NK 試劑 A, 1 支：
③NK 試劑 B, 1 支：
④NK 試劑 C, 1 支:
⑤NK 試劑 D, 1 支：
⑥NK 試劑 E, 1 支：
培養體系中需用到 2 支（100 萬 IU/支）rH IL-2

 

2. 原材料
1. 采取外周血（可從臍血、骨髓等組織）
2. 需的試劑耗材包括：
0.4% 苔盼藍溶液、生理鹽水、人淋巴細胞分離液（建議選用 GE）、175 cm²培養瓶、GT-T610（A）培養袋、15ral/50 ml/250 ml 離心管、移液管、1 毫升無菌注射器

 

3.NK 細胞培養時間過程:
前一天：要提前處理好細胞活化瓶（NK 試劑 A）
第 1 天：進行外周血單個核細胞分離與誘導 (NK 試劑 B）
第 3 天：NK 細胞次補液，補液 50 ml（NK 試劑 C）
第 5 天:NK 細胞第二次補液，補液 175 ml (NK 試劑 D）
第 7 天：NK 細胞第三次補液，裝袋并補液 500 ml (NK 試劑 E)
第 9-10 天：NK 細胞第四次補液，分袋并補液 750 ml
第 12 天：NK 細胞第五次補液. 補液 500 ml
第 13 天：檢菌
第 14、15 天：培養成功
（細胞培養成功時間視具體細胞生長情況而定，在保持培培養基 ph 和細胞活力正常的情況下也可以多培養一天）

 

4. 具體操作步驟如下：
1. 頭一天一定要先處理細胞活化瓶。
2. 將 NK 試劑 A（4 度保存）加入到含有 12.5 ml 生理鹽水的 175 cm²底面積細胞培養瓶中，充分的混勻 30 秒-1 分鐘, 使液體充分在瓶底分散，4 度冰箱平放過夜。
(NK 試劑 A 需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底；次日取出后直接吸棄液體即可，無需清洗)
3. 外周血單個核細胞分離與誘導（第 1 天）
4. 以 100 ml 外周血為例，如血量不同，也可按操作規程做相應調整。
5. 將患者外周血，用移液訝吸取少許原血（約 300 ul）劃線或滴入平皿過行檢菌。然后，正常室溫下, 進行離心。
6. 將上層血漿轉入離心，滅活，離心，取上清液備用。
7. 使用等體積的生理鹽水與血細胞沉淀混勻后，小心加到 Ficoll 層上，使分層保持清晰。室溫內進行離心。
8. 吸取外周血單個核細胞 (PBMC）層，盡量吸盡兩液面交接處的細胞層. 加生理鹽水吹打混勻，離 心。相同方法冉次洗滌細胞。
9. 棄去上清后，用無血清培養基重懸細胞, 吸取少量細胞計數。
10. 按照細胞密度為 1-2*10^6 個/ml(*優為 5 *10^6 個/ml）, 用培養基清洗離心管，并入培養瓶內，并加入 1 支 NK 試劑 B，患者滅活血漿 1.25 ml (5%）確保培養基終體積為 25 ml 左右。剩余血漿 4°C 密封保存備用。
注：包被瓶取出時間為細胞加入前 5 分鐘, 其他時間需在 4 度放置備用。
試劑 A、B、C、D、E 的取用. 違議次吸取原液后. 以適貴培養基沖洗西林瓶后再吸出，以程度減少損耗。
11. 活化培養基的配置：其中 1 瓶無血清培養基中，加入 100 萬 IU 的 IL-2，終濃度為 1000IU/mL。
注：活化培養基每次使用前恢復至室溫。
12.NK 細胞的補液（第 3 天），補加含有 5% 的患者滅活血漿和 NK 試劑 C，確保培養的終體積為 75 mL。(請勿吹打細胞)
13.NK 細胞的第二次補液（第 5 天），補加含有 5% 的患者滅活血漿和 NK 試劑 D, 確保培養的終體積為 250 ml.（請勿吹打細胞）
14.NK 細胞的第三次補液及其裝袋（第 7 天），細胞轉袋前將培養瓶底部的細胞進行輕微吹散細胞，切勿劇烈吹打，隨后將培養瓶的中的細胞懸液及其 500 mL 活化培養基，裝入到細胞培養袋中，同時加入 1 支 NK 試劑 E，及其剩余的全部血漿，確保終體積為 750 ml。
15.NK 細胞的第四次補液（第 9 天），主要為分袋操作，將培養體系由 750 ml 擴增至 1500 ml。
16.NK 細胞的第五次補液（第!2 天）. 主要為補液操作，將剩余的 500 mL 擴增液均分到 2 個培養袋中，確保每袋體積為 1000 ml。
17. 檢菌，細胞培養第 13 天，對細胞懸液進行檢菌、內毒素檢測。用 5 ml 注射器分別從培養瓶和袋內抽取少*細胞懸液，加入正置的平皿中，放入 35℃ 恒溫生化培養箱， 記錄放入日期及培養物品。隔夜后倒置，保留 48 小時。
18. 收獲，正常情況下，第 13, 14 天各收獲 1000 ml 細胞懸液。若因臨床需要進行提前或延遲回輸，也可相應提前或延遲。（NK 細胞建議 2-4 h 之內使用，以保證其活性）

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司