技術文獻
本文重點講述 IHC 操作流程中的關鍵步驟，并提供數據以支持及解釋 CST 在實驗過程中所提的建議。*后，本指南列出了 CST 科學家內部常用且*適用于與抗體配套使用的 IHC 試劑。
抗原修復—熱誘導的抗原表位修復 (HIER)
緩沖液
適用于 HIER 的緩沖液有多種。而 CST 常推薦的兩種緩沖液是：pH6, 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液和 pH 8, 1 mM EDTA 緩沖液。緩沖液是否適用于您的實驗取決于您所使用的一抗。請查閱產品說明書中所推薦的用于特異性抗體的修復緩沖液。一般而言，EDTA 緩沖液適用于多數磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液適用于其他多數抗體。每天都需制備新鮮的 1X 溶液。
抗體：hospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb
樣本：蠟包埋人類肺部腫瘤
抗原修復緩沖液：檸檬酸鹽緩沖液或者 EDTA 緩沖液
煮沸裝置
載玻片在所推薦的緩沖液中加熱煮沸一段時間后，才可引起抗原修復。該步驟通常在微波爐或高壓鍋中進行。雖然，一些研究人員也使用水浴鍋，但是，因為該步驟中所選擇的裝置對染色存在積極或消極的影響。所以，我們建議使用微波爐或高壓鍋加熱煮沸以達到抗原修復效果。
抗體：Phospho–Stat3 (Tyr705)(D3A7) XP. Rabbit mAb
樣本：石蠟包埋人類肺部腫瘤樣本
煮沸設備：浴鍋 ，微波爐，高壓鍋
免疫染色—封閉
在 IHC–P 中，我們建議在室溫下在含有 Tween20 的 TBST 緩沖液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封閉樣品，時長 1 小時，以防止非特異性背景染色。在進行 IHC–F 時，在含有 0.3% Triton. X–100 的 1X TBS 和 5% NGS 中封閉樣品。市售的含有酪蛋白的封閉溶液與磷酸化的一抗結合后易減弱信號；因此，我們建議不使用含有酪蛋白的封閉劑進行磷酸化特異性抗體的檢測。以上針對封閉步驟所提建議均是在以 SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作為檢測試劑的情況下提出的。如果選擇使用其他檢測試劑，我們則建議使用與二抗來源相同的血清進行封閉。
抗體：Phospho–Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb
樣本：石蠟包埋人類乳xian腫瘤
封閉：含 5% 山羊血清 (NGS) 的 TBST或者基于酪蛋白封閉劑
一抗孵育—抗體稀釋液
在 IHC–P 中，有多種抗體稀釋液可供選擇，但是所選擇的抗體稀釋劑對染色效果具有顯著影響。在 CST，我們利用 SignalStain. 抗體稀釋液、TBST/5% NGS（含 5% 山羊血清的 TBST）或者 PBST/5%NGS(含 5％ 山羊血清的 PBST) 來稀釋一抗。因為合適的稀釋劑具有抗體特異性；因此，查閱產品說明書中針對使用的抗體所推薦的稀釋劑。在進行 IHC–F 過程中，一抗應在封閉緩沖液 (TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS) 中稀釋。
抗體：Phospho–Akt (Ser473) (D9E) XP. Rabbit mAb、Phospho–EGF
Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb
樣本：石蠟包埋人類乳xian腫瘤和 HCC827 異種移植物
抗體稀釋：SignalStain. 抗體稀釋液或 TBST/5%NGS
檢測—檢測系統
傳統的 IHC 檢測方法利用了親和素和生物素間的天然親和性。這種親和素–生物素–復合物 (ABC) 系統需要進行兩步法檢測：包括結合生物素化二抗后暴露于親和素–HRP 復合物，然后進行顯色反應。基于生物素的系統容易導致背景染色，特別是含有大量內源性生物素的肝臟、腎臟等組織。因此，我們建議使用基于聚合物的檢測系統，如 SignalStain. Boost IHC 檢測試劑。該基于聚合物的檢測系統不含生物素，而包含了直接偶聯于聚合物主鏈上的酶和二抗。SignalStain. Boost IHC 檢測試劑具有高敏感性并消除因內源性生物素所致的假陽性染色，其檢測過程省去一個步驟為檢測過程節省了時間，并且其與所有基于過氧化物酶的底物相容。
抗體：Sox2 (D6D9) XP. Rabbit mAb
樣本：石蠟包埋的人類肺部腫瘤
檢測：基于生物素的檢測或基于聚合物的檢測（SignalStain. Boost IHC Detection Reagent
色原
二氨基聯苯胺 (DAB) 底物是基于過氧化物酶檢測系統中*常用的色原。DAB 與 HRP 反應以在抗體結合處形成棕色沉淀物。在實驗中建議始終使用高質量的 DAB 底物。在 CST 公司，IHC 小組的 CST 科學家內部鑒定 IHC 抗體所使用的都是 SignalStain. DAB 底物試劑盒。SignalStain. DAB 底物試劑盒敏感性高，且與一抗的作用效果。在 TBST 中清洗 3 x 5 分鐘（若為 IHC–F，則在 TBS 中清洗 3 x 5 分鐘），以清除未結合的二抗，隨后將 100–400μl SignalStain. DAB 應用于每一個組織切片并密切監控以得到合適的顯色。一般而言，1–10 分鐘即可獲得可接受的染色強度。獲得合適的染色強度后，將載玻片置于蒸餾水 (dH2O) 中以阻止進一步顯色。
抗體：Phospho–Stat3(Tyr705)(D3A7) XP? Rabbit mAb
樣本：石蠟包埋的人類乳xian腫瘤
顯色檢測：利用 SignalStain? DAB Substrate Kit ，競爭者提供的 DAB
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
請輸入要搜索的關鍵詞
上海遠慕生物科技有限公司：細胞凍存液,氨芐青霉素溶液,人白介素ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,顯色試劑盒,新生牛血清,標準胎牛血清,牛血清白蛋白溶液,小鼠血漿,雞紅細胞,透明質酸酶溶液,微生物培養基,胰蛋白酶儲存液,兩性霉素B溶液,LB冷凍緩沖液,ABTS試劑,磷酸酶抑制劑,EB緩沖液,熒光染色試劑盒,肥大細胞染色液,人源基因質粒,胡蔓藤堿乙標準品,番茄紅素標準品，Pd-C-II標準品,知母皂苷E標準品,穿刺培養基,puc19質粒,CPD抗凝劑,熒光抗體稀釋液
地址：上海市嘉定區曹安公路5588號 電話：021-58999639 傳真：021-58999639 技術支持：阿儀網 總訪問量：7742775
客服一
