P物質（SP）檢測
試劑盒 檢測范圍 12.35-1000pg/mL 靈敏度 4.84pg/mL
樣本類型 Serum, plasma, tissue homogenates, cell lysates, cell culture supernates ａnd otherbiological fluids.
實驗時長 2.5h 實驗方法 競爭抑制法
P物質（SP）檢測試劑盒（酶聯免疫吸附試驗法）
適用生物：人
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷！
P物質（SP）檢測試劑盒[預期應用]
本試劑盒運用競爭抑制ELISA 法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、
細胞培養上清或其它相關生物
液體中SP 含量。
[試劑盒內容]
試劑名稱數量試劑名稱數量
96孔板（預包被） 1 96孔板覆膜4
標準品2 標準品稀釋液1×20mL
檢測
溶液A 1×120μL 檢測稀釋液A 1×12mL
檢測溶液B 1×120μL 檢測稀釋液B 1×12mL
TMB底物1×9mL 終止液1×6mL
濃洗滌液（30×） 1×20mL 使用說明書1
[需自備的設備及試劑]
1、450±10nm 濾光片的酶標儀（建議
儀器使用前提前預熱）
2、單道或多道微量加液器及吸頭
3、稀釋樣品的EP 管
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、盛放洗液的容器
[試劑盒的儲存及有效期]
1、未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶液A、檢測溶液B 以及96 孔板保存于-20oC。
2、使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20oC，避免潮濕。
注意：
試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后1 個月內使用完畢。
產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩定的。
[標本的采集與保存]
1、血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2 小時或4oC 過夜，然后1000×g 離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
2、血漿：用EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30 分鐘內于2-8oC 1000×g 離心15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
3、組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預冷PBS 進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2 次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。
4、細胞裂解液：
1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。
ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20oC 以下冰凍，室溫融解，反復3 次，使細胞溶脹破碎。
4）將標本于2-8oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5、細胞培養上清或其它生物標本：請1000×g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
注意：
1、以上標本均需密封保存，4oC 保存應小于1 周，-20oC 不應超過1 個月，-80oC 不應超過2 個月。
2、標本溶血會影響*后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
3、標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。
[試劑準備]
1、使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫（18-25oC），試劑不能直接在37oC 溶解。
2、標準品（凍干品）：每瓶標準品加入標準品稀釋液1.0mL，蓋好后室溫靜置大約10 分鐘，同時反復顛倒/搓動
以助溶解，其濃度為1,000pg/mL。準備5 個稀釋標準品的EP 管，每個EP 管中加入600μL 的標準品稀釋液，
依次三倍稀釋成1,000pg/mL, 333.33pg/mL, 111.11pg/mL, 37.04pg/mL, 12.35pg/mL，標準品稀釋液（0pg/mL）直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
Tube 1 2 3 4 5 6
pg/mL 1,000 333.33 111.11 37.04 12.35 0
3、檢測溶液A 及檢測溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A 或B1:100 稀釋（如：10μL 檢測溶液A/990μL 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（50μL/孔），實際配制時應多配制
0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進行30 倍稀釋。
5、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，不要倒回TMB 瓶中。
注意：
1、標準品的稀釋不能直接在板中進行。
2、標準品請于臨用前15 分鐘內配制。該標準品只能使用一次。
3、標準品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆。混勻時要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據所需的量精確配制，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10μL），以避免造成濃度誤差。
4、請勿重復使用已經稀釋過的標準品、檢測溶液A 工作液和檢測溶液B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結晶完全溶解再進行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質量差或水質污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結果不準確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。
[標本處理]
1、本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
2、實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。標本使用0.01mol/L 的PBS 稀釋（PH=7.0-7.2）。
3、若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4、使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA 實驗結果偏差。
5、若樣本為細胞培養上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6、某些天然
蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7、建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結果偏差。
[操作步驟]
1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔5 孔，依次加入50μL 不同濃度的標準品（見試劑準備2）。空白孔加50μL（見試劑準備第二步*后一管），余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加檢測溶液A工作液50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標板加上覆膜，37oC 溫育1 小時。
2、棄去孔內液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內液體拍干），重復洗板3 次。*后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。
3、每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
4、棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37oC 避光顯色（反應時間控制在15-25 分鐘，不要超過30 分鐘。當標準孔的后面3 孔有明顯的梯度藍色，前3 孔梯度不明顯時，即可終止）。
6、每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
7、在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm 波長測量各孔的光密度（O.D.值）。
注意：
1、試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，個孔與*后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10 分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
5、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
客服一
