細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題
1.為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代？
答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)得以繼續(xù)。
2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？
答：通常細(xì)胞生長(zhǎng)得非常快時(shí)，pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。
(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％。
(2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。
(3)松開瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。
(4)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。
(5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
3.培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響？
答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。
4.購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，用離心去除DMSO比較好。
5.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；細(xì)胞置于–80℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。
6.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
7.冷凍保存細(xì)胞之方法？
答：冷凍保存方法一:冷凍管置于4℃(30－60分鐘)→-20℃(30分鐘)→-80℃(16－18小時(shí)或隔夜)→液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。注意：-20℃不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
9.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
答：欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300×g(約1,000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速過長(zhǎng)時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對(duì)離心決定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部?jī)?nèi)壁的距離；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF(relativeeentrifugalforce)為相對(duì)離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示表示單位。
10.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？
答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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