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樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項
閱讀次數：1878 發布時間：2016/11/25 15:59:08

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    樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項

    樣本制備是實驗的步，也是決定實驗成敗的關鍵步驟，獲得的蛋白質樣品必須均質、可溶，并解離成單個多肽亞基，且盡量減少相互間的聚集，使其*終僅依賴本身的分子量大小進行分離。常見的樣本來源有重組蛋白、細胞和組織等。上海遠慕生物技術與您一起分享關于蛋白提取的總原則以及注意事項：

    蛋白提取的總原則和注意事項：

    1.盡可能提取完全或降低樣本復雜度，只集中提取目的蛋白；

    2.保持蛋白處于溶解狀態（通過裂解液的pH鹽濃度，表面活性劑，還原劑等的選擇）；

    3.提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；

    4.盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）；

    5.樣品分裝，長期于-80℃保存，避免反復凍融。

    細胞裂解：

    1.培養的細胞經預冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑；

    2.吸盡PBS，加入預冷的裂解液（1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask）；

    3.用細胞刮子刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液溫和地轉移至預冷的微量離心管中；

    4.4℃搖動30mins；

    5.4℃，12000rpm離心20mins；

    6.輕輕吸取上清，轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀。

    組織裂解：

    1.用滅菌的預冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解；

    2.將組織放在圓底微量離心管或EP管中，加入液氮凍結組織于冰上勻質研磨，長期可保存于-80℃；

    3.每5mg加入約300ul預冷的裂解液，冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當比例（*終的蛋白濃度至少達0.1mg/ml，理想的蛋白濃度應為1-5mg/ml）；

    4.4℃，12000rpm離心20mins，輕輕吸取上清，轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀。

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司