涂片及染色是微生物學(xué)的基本技術(shù)，也是觀察細(xì)菌簡單且行之有效的方法。通常情況下，由于細(xì)菌個體較小，較透明或半透明，如未經(jīng)染色往往不以觀察識別。因此借助于染色法可以使細(xì)菌著色，與視野背景形成鮮明對比，從而易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。
常見的染色方法包括簡單染色、負(fù)染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色、死活染色。制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟，然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。
簡單染色：
不同細(xì)菌或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同，所以使用的染料也有差異，但是簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對應(yīng)的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時間，染色時間到達(dá)時，進(jìn)行水洗，干燥等步驟。/后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過程。
負(fù)染色：
制備觀察圖片是非常容易的，但是對初學(xué)者來說想要在玻片中找到目標(biāo)菌還是有一定難度的，因?yàn)榧?xì)菌常常無色透明且比較小，所以對初學(xué)者來說除非對光圈等進(jìn)行很精細(xì)的調(diào)節(jié)，否則很難觀察到目標(biāo)菌，因此進(jìn)行負(fù)染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑或者india墨水混合，再將混合物覆蓋于載玻片表面，由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細(xì)胞，所以使得透明的微生物個體在黑色的背景下很容易觀察。負(fù)染色法常見有兩種操作方法。
第1種發(fā)個方法比較常見，在一個載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合，用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄，在厚與薄中間的額區(qū)域就是/佳觀察區(qū)域。
第二種方法是用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合，用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。
革蘭氏染色：
革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不會脫去，有的可以被脫去，者叫做革蘭氏陽性菌，后者為革蘭氏陰性菌。為方便進(jìn)一步觀察，脫色后再用堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染，陽性菌仍為紫色，陰性菌染成紅色，這就是革蘭氏染色的原理。其步驟包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個步驟.
芽孢染色法：
部分細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入，在革蘭氏染色法涂片染色時，革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到，但在不易清晰觀察時，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復(fù)紅染色法。
孔雀綠染色法的具體步驟：先將生有芽孢的斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和孔雀綠水溶液染色10min，然后用自來水沖洗，沖洗完后用0.5%蕃紅液復(fù)染30s，用水洗，吸干，即可鏡檢，鏡檢時芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。
石碳酸蕃紅染色法具體步驟：先按常規(guī)涂片，然后滴加石碳酸復(fù)紅于涂片上，并于玻片下緩緩加熱，使染液冒蒸汽但不沸騰，并繼續(xù)滴加染液，不使涂片上染液蒸干，這樣保持5min。帶涂片冷卻后，傾去染液，用酸性乙醇脫色指無紅色染劑洗脫為止，接著徹/底水洗，洗后用呂氏美藍(lán)復(fù)染2-3min，水洗吸干后即可進(jìn)行鏡檢，鏡檢時菌體計(jì)孢囊呈藍(lán)色，芽孢呈紅色。
鞭毛染色法：
鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動器官，非常纖細(xì)，超出了光學(xué)顯微鏡觀察限，因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復(fù)紅沉淀法兩種。這里介紹一下銀鹽沉淀法。用作鞭毛染色的載玻片必須是絕對干凈無油脂的，將載玻片在火焰上快速灼燒5s，放在染色架上冷卻，用蠟筆分成兩個區(qū)域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL無菌水加入到幼齡生長活躍的斜面菌株中，慢慢震蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮，盡量避免使用接種環(huán)，將懸液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，通過懸滴試驗(yàn)檢查菌體的運(yùn)動型，用無菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止，放入20-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端，傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線，在空氣中自然干燥。然后用媒染色劑媒染5min之后，慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液，用熱的Fontana銀鹽覆蓋，染色5min，每隔1min更換一次染色液（Fontana銀液在沸水浴中加熱），細(xì)菌涂層的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。有用水沖洗，自然晾干即可進(jìn)行鏡檢。應(yīng)當(dāng)注意一點(diǎn)，染色法的燃料須當(dāng)日配制，4h內(nèi)使用，/好是現(xiàn)配現(xiàn)用。
莢膜染色：
一般細(xì)菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可以透過莢膜使菌體著色。一般采用負(fù)染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來便于觀察分辨。莢膜染色的步驟：加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端，無菌操作，挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合，加1滴墨汁充分混勻，用推片法制片將菌液鋪成薄層，自然干燥，滴加1-2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗一次，使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。
死活染色：
死活染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法，是利用死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來進(jìn)行的，常用的染色劑有臺盼藍(lán)和美藍(lán)，者使用范圍較廣，后者一般在酵母菌細(xì)胞死活鑒定上使用較多。
以上介紹的染色法，基本上涵蓋傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室能用到的所有的染色法。染色法在細(xì)菌的觀察、分類、鑒定中經(jīng)常用到，因此是微生物檢測人員不可或缺的基本技能。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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